Preparación de una sola célula suspensiones de bazo de ratón con el disociador gentleMACS

Resumen

Este video describe un simple ahorro de tiempo para la técnica de la disociación del tejido automatizado utilizando el disociador gentleMACS para preparar una sola célula suspensiones de esplenocitos de ratón.

Resumen

Una sola célula suspensiones son un requisito previo para realizar experimentos en la separación celular, el análisis de células y cultivos celulares. Para evitar disociaciones manual tedioso ya menudo dolorosa la disociador gentleMACS permite disociar los tejidos de manera muy eficiente en condiciones controladas y reproducibles. El disociador gentleMACS óptima se puede disociar de bazo de ratón, la combinación de ahorro de tiempo y de normalización por el usuario de seguridad. Este vídeo se describe cómo disociar el bazo del ratón con el disociador gentleMACS, un sistema automatizado de sobremesa dispositivo mecánico que puede alterar los tejidos que utilizan tubos especiales para producir suspensiones de células viables. Después de la disociación, el bazo se filtra, se centrifuga y se resuspende para otras aplicaciones.

Protocolo

Introducción a los Equipos

1. Tejido es ligeramente disociado, con violeta tubos C en viable una sola célula suspensiones.
2. El tampón PBS / BSA EDTA se utiliza para disociar las células. El buffer se prepara añadiendo una parte de la solución de archivo BSA a 20 partes de autoMACS Solución de enjuague que contiene EDTA.
3. El MACS separación pre-filtros se utilizan para que las muestras de tejido disociado están libres de todos los grupos de células, la promoción de la separación MACS éxito y su posterior análisis.

Disociar las células del bazo

1. El bazo entero se disscociated en una sola célula suspensiones de esplenocitos con el disociador gentleMACS.
2. Para comenzar el procedimiento, el tubo de carga C con un volumen de tampón de acuerdo a la masa del bazo. Un bazo sano de un adulto joven hembra BALB / c ratón pesa alrededor de 80-120 mg. Cada 1 a 2 bazos de esta masa requiere de 3 ml de solución tampón. El bazo de los animales más viejos o los animales con infecciones suelen ser mayores y se deben sopesar en el buffer. Los volúmenes de almacenamiento intermedio debe ser reducido en consecuencia. No excedan de un volumen total de memoria intermedia de 10 ml.
3. Añadir el bazo diseccionados para el metro C con 3 ml de solución tampón.
4. Asegúrese de que la tapa del tubo C es apretado y conectar el tubo de C a la disociador con la tapa hacia abajo.
5. Encienda el disociador. Por 1-2 el bazo, seleccione m_spleen_01 programa. El programa tendrá 56 segundos para completar. Si el número de bazo es mayor, use el programa m_spleen_04, este programa puede ser utilizado para un máximo de 720 mg de tejido esplénico.
6. Después de completar el programa de los tejidos del bazo nativos se disocia en una suspensión de esplenocitos.
7. Centrifugar la suspensión de células enteras en 300xg a temperatura ambiente durante unos 30 segundos. Esto asegurará que el rotor y el estator se libera de todas las células que se recogen en la parte inferior del tubo C.
8. Retire la muestra a través del tabique sellado de apertura en la tapa del tubo con una pipeta de C 1000 microlitros.

Filtración de paso

1. Para comenzar la etapa de filtración, aplicar el tejido disociado al filtro de pre-separación o un colador de células con un tamaño de micras de poro 30. El filtro debe ajustarse a un tubo de 15 ml por 1-2 el bazo o un tubo de 50 ml por más de 2 bazos.
2. Deje que la suspensión de células pasan a través. A continuación, lavar el filtro mediante la aplicación de 5 ml de solución tampón.
3. Ahora, centrifugar el tubo con la suspensión celular a 300xg, a temperatura ambiente durante 10 minutos para recoger todos los esplenocitos en un pellet de células del bazo.
4. Ahora, que tenemos una bolita de esplenocitos disociado, que debe aspirar el sobrenadante y resuspender el botón celular en una cantidad adecuada de tampón.

La disociación del bazo con el disociador gentleMACS dará un alto porcentaje de esplenocitos viables, lo cual es demostrado por citometría de flujo utilizando el analizador de MACSQuant. Las células muertas se tiñen con yoduro de propidio. En el ejemplo proporcionado, la dispersión frontal lado gráfico de puntos muestra los esplenocitos preparado.

Discusión

Para evitar disociaciones manual tedioso ya menudo dolorosa, el disociador gentleMACS permite disociar los tejidos de manera muy eficiente en condiciones controladas y reproducibles. El procedimiento de disociación del tejido es suave con las células y las suspensiones de producción de células con una tasa alta viabilidad. El disociador gentleMACS en combinación con C Tubos está diseñado para la preparación de una sola célula suspensiones de varios tejidos. El instrumento está equipado con una serie de programas pre-establecidos para disociar de bazo de ratón, hígado, pulmón, o en el tejido neural. La gama de programas y protocolos serán continuamente expandido para incluir otros tejidos.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentleMACS™ Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-093-235	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx
13 mL Tubes	Miltenyi Biotec	130-091-596	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx
autoMACS™ Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx
MACS® BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx
Pre-Separation Filters	Miltenyi Biotec	130-041-407	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx
MACSQuant Analyzer	Miltenyi Biotec	130-092-197
Propidium Iodide Solution	Miltenyi Biotec	130-093-233	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx