Подготовка одноклеточных суспензий из селезенки мыши с gentleMACS диссоциатор

Резюме

Это видео описывает простой, экономящий время техника для автоматизированного диссоциации ткани с помощью диссоциатор gentleMACS подготовить одноклеточных суспензий мыши спленоцитов.

Аннотация

Single-клеточные суспензии, являются необходимым условием для проведения экспериментов в ячейке разделения, клеточный анализ и клеточных культур. Чтобы избежать утомительного и часто болезненных диссоциации ручной диссоциатор gentleMACS позволяет отделить ткани очень эффективно в контролируемых и воспроизводимых условиях. Диссоциатор gentleMACS может оптимально отделить селезенки мыши, сочетая экономию времени и стандартизации с пользователем безопасности. Это видео описывает, как отделить мыши селезенки использованием gentleMACS диссоциатор, автоматизированных настольный прибор, который может нарушить механически тканей с помощью специальных труб для получения жизнеспособных клеточных суспензий. После диссоциации, селезенки фильтруют, центрифугируют и ресуспендируют для дальнейшего применения.

протокол

Введение в оборудование

1. Ткань мягко диссоциированных, используя фиолетовый C Трубы в жизнеспособные одноклеточных суспензий.
2. PBS / BSA ЭДТА буфер используется для диссоциации клеток. Буфер получают путем добавления 1 часть маточного раствора BSA до 20 частей autoMACS Полоскание раствором, содержащим ЭДТА.
3. MACS Предварительное разделение Фильтры используются, чтобы диссоциированных образцов тканей свободны от всех клеточных сгустков, способствующих успешному разделения MACS и последующего анализа.

Диссоциирующего клеток селезенки

1. Всего селезенки являются disscociated в одноклеточных суспензий спленоцитов использованием диссоциатор gentleMACS.
2. Чтобы начать процедуру, нагрузка труб С с объемом буфера в зависимости от массы селезенки. Здоровой селезенки молодых взрослых самок мышей BALB / с мышь весит около 80-120 мг. Каждый 1 до 2 селезенки этой массы требуют 3 мл буфера. Селезенки от старых животных или животных с инфекциями часто большие и должны быть взвешены в буфере. Буфера тома должны быть расширены соответственно. Не превышать общий объем буфера 10 мл.
3. Добавить расчлененный селезенки, чтобы труба С, содержащий 3 мл буфера.
4. Убедитесь, что крышка C Трубка плотно и прикрепите трубы С до диссоциатор с цоколем вниз.
5. Включите диссоциатор. Для 1-2 селезенки, выберите программу m_spleen_01. Программа займет 56 секунд. Если число селезенки больше, используйте программу m_spleen_04, эта программа может быть использована для до 720 мг ткани селезенки.
6. После завершения программы нативной ткани селезенки распадается на спленоцитов подвески.
7. Спином вниз все суспензии клеток в 300xg при комнатной температуре в течение примерно 30 сек. Это гарантирует, что ротор и статор, освобождаются от всех клеток, которые собираются в нижней части трубы C.
8. Удалить образец через перегородку уплотнением отверстие в крышке трубы С, используя 1000 мкл pipetter.

Фильтрация шаг

1. Для начала фильтрации шаг, примените диссоциированных тканей предварительного разделения фильтра или ячейки фильтра 30 мкм с размером пор. Фильтр должен соответствовать 15 мл трубки в течение 1-2 селезенки или 50 мл трубки более чем на 2 селезенки.
2. Пусть клеточной суспензии пройти. Затем промыть фильтр, применяя 5 мл буфера.
3. Теперь, центрифуги трубы с клеточной суспензии в 300xg, при комнатной температуре в течение 10 минут, чтобы собрать все спленоцитов в осадок клеток селезенки.
4. Теперь, что у нас есть гранул диссоциированных спленоцитов, мы должны аспирата супернатант и ресуспендируют осадок клеток в соответствующее количество буфера.

Селезенка диссоциации использованием диссоциатор gentleMACS даст высокий процент жизнеспособных спленоцитов, о чем свидетельствует проточной цитометрии с использованием MACSQuant Analyzer. Мертвые клетки окрашиваются по йодида пропидий. В примере, при условии, передней стороне разброс точка графика видно, подготовленные спленоцитов.

Обсуждение

Чтобы избежать утомительного и часто болезненных диссоциации по эксплуатации, диссоциатор gentleMACS позволяет отделить ткани очень эффективно в контролируемых и воспроизводимых условиях. Процедура ткани диссоциации нежно к клеткам и суспензий дает клетка с высокой скоростью жизнеспособность. Диссоциатор gentleMACS в сочетании с C Трубы предназначены для подготовки одноклеточных суспензий из различных тканей. Прибор оснащен рядом предустановленных программ отделить мыши селезенки, печени, легких или нервной ткани. Ряд программ и протоколов будет постоянно расширена за счет включения дополнительных тканей.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentleMACS™ Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-093-235	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx
13 mL Tubes	Miltenyi Biotec	130-091-596	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx
autoMACS™ Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx
MACS® BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx
Pre-Separation Filters	Miltenyi Biotec	130-041-407	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx
MACSQuant Analyzer	Miltenyi Biotec	130-092-197
Propidium Iodide Solution	Miltenyi Biotec	130-093-233	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx