Fare Dalak gentleMACS Dissociator Tek Hücreli Cezalar hazırlanması

Özet

Bu video gentleMACS Dissociator kullanarak fare dalak tek hücre süspansiyonları hazırlamak için otomatik doku ayrılma için basit, zaman tasarrufu sağlayan bir teknik açıklar.

Özet

Tek hücre süspansiyonları hücre ayırma, hücre analizi ve hücre kültürü deneyleri için bir önkoşuldur. GentleMACS Dissociator sıkıcı ve sıklıkla ağrılı manuel dissociations önlemek için kontrollü ve tekrarlanabilir koşullar altında çok etkin bir şekilde doku ayırmak sağlar. GentleMACS Dissociator optimal, kullanıcı güvenliği ile zaman kazandıran ve standardizasyon birleştirerek, fare dalak ayrılabilir. Bu video gentleMACS Dissociator, mekanik, canlı hücre süspansiyonları üretmek için özel tüpler kullanılarak dokuların bozabilir otomatik bir tezgah üstü cihazı kullanarak fare dalak ayırmak anlatılmaktadır. Disosiasyon ardından, dalak, süzülür ve başka uygulamalar için yeniden süspanse.

Protokol

Equipment Giriş

1. Doku uygulanabilir tek hücre süspansiyonları içine menekşe C Tüpler kullanarak, hafifçe ayrışmış.
2. PBS / BSA EDTA tampon hücreleri ayırmak kullanılır. Tampon BSA Stok çözelti, EDTA içeren Çözüm Durulama autoMACS 20 kısım 1 kısım ekleyerek hazırlanır.
3. MACS Ön Ayırma Filtreler başarılı MACS ayrılması ve daha sonraki analiz teşvik ayrışmış doku örnekleri tüm hücre kümeleri, böylece kullanılır.

Dalak hücreleri Dissociating

1. Tüm dalak dalak gentleMACS Dissociator kullanarak tek hücre süspansiyonları disscociated.
2. Prosedürü başlatmak için, dalak, kitle göre tampon hacmi ile C Tüp yük. Genç bir yetişkin erkek BALB / c fare sağlıklı bir dalak 80-120 mg ağırlığındadır. Bu kitle her 1 ila 2 dalak 3 mL tampon gerektirir. Enfeksiyonları ile büyük hayvan veya hayvanların dalak genellikle büyük ve tampon tartılır olmalıdır. Tampon hacimleri buna göre ölçeklenmiş olmalıdır. 10 ml toplam tampon hacmi aşmayın.
3. 3 ml tampon içeren C Tüp disseke dalak ekleyin.
4. C Tüp kapağı sıkı olduğundan emin olun ve kapağı aşağı dissociator C Tüp takmak.
5. Dissociator kadar güç. 1-2 dalak için program m_spleen_01 seçin. Programını tamamlamak için 56 saniye sürer. Dalak, sayı büyükse, program m_spleen_04 kullanın, bu program 720 mg dalak doku için kullanılabilir.
6. Programın tamamlanmasından sonra yerli dalak doku splenocyte süspansiyon ayrışmış.
7. Yaklaşık 30 saniye boyunca oda sıcaklığında 300xg tüm hücre süspansiyonu aşağı spin. Bu rotor ve stator C Boru altında toplanan tüm hücreleri serbest olmasını sağlayacaktır.
8. 1000 mikrolitrelik pipetter kullanarak septum-C Tüp kapağı kapalı açılış ile örnek çıkarın.

Filtrasyon adım

1. Filtrasyon adım başlamak için, Pre-Ayırma Filtre ya da 30 mikron gözenek boyutu ile bir hücre süzgeç ayrışmış doku geçerlidir. Süzgeç fazla 2 dalak, 1-2 dalak ya da 50 ml tüp 15 ml tüp uygun olmalıdır.
2. Hücre süspansiyonu geçmesine izin verin. Daha sonra 5 ml tampon uygulayarak filtre yıkayın.
3. Şimdi, bir dalak hücre pelletini tüm splenositlerin toplamak için 10 dakika boyunca oda sıcaklığında, 300xg hücre süspansiyonu ile tüp santrifüj.
4. Şimdi, ayrışmış splenositlerin bir pelet, süpernatantı aspirat ve tamponu uygun bir miktarda hücre pelletini tekrar süspansiyon gerekir.

Dalak ayrılma gentleMACS Dissociator kullanarak canlı splenositlerin MACSQuant Analyzer kullanarak flow sitometri gösterdiği yüksek bir yüzdesi verecektir. Ölü hücreler propidium iyodür tarafından lekeli. Verilen örnekte, ileri yan dağılım nokta arsa hazırlanan splenositlerin gösterir.

Tartışmalar

GentleMACS Dissociator sıkıcı ve sıklıkla ağrılı manuel dissociations önlemek için, kontrollü ve tekrarlanabilir koşullar altında çok etkin bir şekilde doku ayırmak sağlar. Doku disosiasyon prosedürü yüksek canlılık oranı ile hücre ve verim hücre süspansiyonları yumuşaktır. C Tüpleri ile birlikte gentleMACS Dissociator, çeşitli dokuların tek hücre süspansiyonları hazırlanması için tasarlanmıştır. Cihaz fare dalak, karaciğer, akciğer veya sinir doku ayırmak önceden belirlenmiş programları bir dizi ile donatılmıştır. Çeşitli programların ve protokollerin ek dokuların sürekli kapsayacak şekilde genişletildi olacaktır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentleMACS™ Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-093-235	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx
13 mL Tubes	Miltenyi Biotec	130-091-596	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx
autoMACS™ Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx
MACS® BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx
Pre-Separation Filters	Miltenyi Biotec	130-041-407	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx
MACSQuant Analyzer	Miltenyi Biotec	130-092-197
Propidium Iodide Solution	Miltenyi Biotec	130-093-233	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx