הכנת תא בודד השעיות מן הטחול עכבר עם Dissociator gentleMACS

Summary

וידאו זה מתאר פשוטים, חוסך זמן טכניקה ניתוק אוטומטי רקמות באמצעות Dissociator gentleMACS להכין תא בודד השעיות של splenocytes העכבר.

Abstract

תא בודד המתלים הם תנאי הכרחי ניסויים ההפרדה התא, ניתוח התא תרבית תאים. כדי להימנע dissociations ידני מייגע וכואב לעיתים קרובות Dissociator gentleMACS מאפשרת לנתק רקמה ביעילות רבה בתנאים מבוקרים לשעתקו. Dissociator gentleMACS ניתן לנתק בצורה אופטימלית טחול עכבר, שילוב timesaving וסטנדרטיזציה עם בטיחות למשתמש. וידאו זה מתאר כיצד לנתק spleens העכבר באמצעות Dissociator gentleMACS, מכשיר אוטומטי הספסל העליון שיכולים לשבש באופן מכני לרקמות באמצעות צינורות מיוחדים כדי לייצר השעיות תא קיימא. בעקבות הניתוק, spleens מסוננים, centrifuged ו resuspended עבור יישומים נוספים.

Protocol

מבוא ציוד

1. רקמות הוא ניתק בעדינות, בעזרת צינורות סגול C לתוך תא בודד השעיות קיימא.
2. המאגר PBS / BSA EDTA משמש לנתק את התאים. המאגר מוכן ידי הוספת 1 חלק מהפתרון במלאי BSA עד 20 חלקים autoMACS שטיפת פתרון המכיל EDTA.
3. MACS טרום ההפרדה מסננים משמשים כך דגימות רקמה ניתק הן ללא כל גושים התא, לקדם הפרדה MACS מוצלח וניתוח שלאחר מכן.

Dissociating בתאי הטחול

1. Spleens שלמות disscociated לתוך תא בודד השעיות של splenocytes באמצעות Dissociator gentleMACS.
2. כדי להתחיל את ההליך, לטעון את Tube C בהיקף של המאגר על פי המסה של spleens. הטחול בריא של עכבר צעיר מבוגר נשים BALB / c שוקל כ 80-120 מ"ג. כל 1-2 spleens של מסה זו דורשת 3 מ"ל של המאגר. Spleens מבעלי חיים או בבעלי חיים מבוגרים עם זיהומים הם לעתים קרובות גדולים יש לשקול במאגר. נפח המאגר חייב להיות מדורגים בהתאם. לא יעלה על נפח המאגר כולל של 10 מ"ל.
3. מוסיפים את הטחול גזור אל התחתית C המכיל 3 מ"ל של המאגר.
4. ודא כובע Tube C הוא חזק לצרף את Tube C כדי dissociator עם כובע ומטה.
5. כוח עד dissociator. במשך 1-2 spleens, בחר m_spleen_01 התוכנית. התוכנית ייקח 56 שניות כדי להשלים. אם מספר spleens גדול, להשתמש בתוכנית m_spleen_04: תוכנית זו יכולה לשמש עד 720 מ"ג של רקמת טחול.
6. לאחר השלמת התוכנית רקמת טחול יליד הוא ניתק לתוך השעיה splenocyte.
7. ספין את ההשעיה התא כולו בבת 300xg בטמפרטורת החדר למשך כ -30 שניות. זה יבטיח כי הרוטור ואת הסטטור משוחררים של כל התאים אשר נאספים בתחתית של התחתית C.
8. הסר את המדגם דרך הפתח, מחצה חתום כובע Tube C באמצעות pipetter 1000 microliter.

סינון צעד

1. כדי להתחיל את שלב הסינון, להחיל את רקמת ניתק על סנן ההפרדה טרום או מסננת תא בגודל 30 מיקרומטר הנקבוביות. מסננת צריך להתאים צינור 15 מ"ל במשך 1-2 spleens או שפופרת 50 מ"ל במשך יותר מ 2 spleens.
2. בואו ההשעיה התא לעבור. ואז לשטוף את המסנן על ידי יישום של 5 מ"ל חיץ.
3. עכשיו, צנטריפוגה הצינור עם ההשעיה התא 300xg, בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי לאסוף את כל splenocytes בתא הטחול גלולה.
4. עכשיו, שיש לנו גלולה של splenocytes ניתק, עלינו לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה בסכום המתאים של המאגר.

דיסוציאציה הטחול באמצעות Dissociator gentleMACS תניב אחוז גבוה של splenocytes קיימא, אשר באה לידי ביטוי cytometry זרימה באמצעות Analyzer MACSQuant. תאים מתים הם מוכתמים על ידי יודיד propidium. בדוגמה סיפקה, לצד פיזור העלילה קדימה נקודה מציגה את splenocytes מוכן.

Discussion

כדי להימנע dissociations ידני מייגע וכואב לעיתים קרובות, את Dissociator gentleMACS מאפשרת לנתק רקמה ביעילות רבה בתנאים מבוקרים לשעתקו. ההליך רקמת ניתוק עדין לתאים התשואות השעיות תא עם קצב כדאיות גבוהה. Dissociator gentleMACS בשילוב עם C צינורות נועד להכנת תא בודד השעיות מרקמות שונות. המכשיר מצויד במספר שנקבע מראש תוכניות לנתק עכבר הטחול, הכבד, הריאות, או רקמה עצבית. מגוון של תוכניות ופרוטוקולים יורחב ברציפות לכלול רקמות נוספות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentleMACS™ Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-093-235	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx
13 mL Tubes	Miltenyi Biotec	130-091-596	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx
autoMACS™ Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx
MACS® BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx
Pre-Separation Filters	Miltenyi Biotec	130-041-407	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx
MACSQuant Analyzer	Miltenyi Biotec	130-092-197
Propidium Iodide Solution	Miltenyi Biotec	130-093-233	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx