Preparazione di Single-Cell Sospensioni da Spleen mouse con il dissociatore gentleMACS

Riepilogo

Questo video descrive un semplice, di risparmiare tempo tecnica per la dissociazione dei tessuti automatizzato mediante il dissociatore gentleMACS per preparare cella singola sospensioni di splenociti mouse.

Abstract

Monocellulari sospensioni sono un prerequisito per esperimenti di separazione delle cellule, l'analisi delle cellule e coltura delle cellule. Per evitare di dissociazioni manuali ripetitive e spesso doloroso il dissociatore gentleMACS permette di dissociare i tessuti in maniera molto efficiente, in condizioni controllate e riproducibili. Il dissociatore gentleMACS può dissociarsi in modo ottimale milza del mouse, coniugando risparmio di tempo e di normalizzazione dall'utente sicurezza. Questo video spiega come dissociare milza del mouse utilizzando il dissociatore gentleMACS, un sistema automatico da banco dispositivo in grado di distruggere meccanicamente i tessuti con tubi speciali per la produzione di sospensioni di cellule vitali. A seguito di dissociazione, milza vengono filtrati, centrifugati e risospesi per ulteriori applicazioni.

Protocollo

Introduzione alla Attrezzature

1. Il tessuto è leggermente dissociato, utilizzando viola Tubi C in singola cellula vitale sospensioni.
2. La PBS / BSA tampone EDTA è usato per separare le cellule. Il buffer è preparato con l'aggiunta di 1 parte di soluzione madre BSA per 20 parti di autoMACS Risciacquo Soluzione contenente EDTA.
3. La pre-separazione filtri MACS sono usati in modo che i campioni di tessuto dissociate sono liberi di tutti i grumi di cellule, favorendo il successo separazione MACS e successiva analisi.

Dissociare le cellule della milza

1. Milze intere disscociated in cella singola sospensioni di splenociti utilizzando il dissociatore gentleMACS.
2. Per iniziare la procedura, caricare la metropolitana C, con un volume di tampone a seconda della massa della milza. Una milza sana di un giovane adulto femmina BALB / c del mouse pesa circa 80-120 mg. Ogni 1 o 2 milza di questa massa richiedono 3 ml di tampone. Milza di animali più vecchi o animali con infezioni sono spesso più grandi e devono essere valutati nel buffer. I volumi buffer deve essere ripartita in proporzione. Non superano un volume totale di buffer di 10 ml.
3. Aggiungere la milza sezionato per la metropolitana C contenente 3 ml di buffer.
4. Assicurarsi che il tappo del tubo C è stretto e collegare il tubo C al dissociatore con il tappo verso il basso.
5. Accendere il dissociatore. Per 1-2 milza, selezionare m_spleen_01 programma. Il programma avrà 56 secondi per essere completata. Se il numero di milza è maggiore, usare il programma m_spleen_04, questo programma può essere utilizzato per un massimo di 720 mg di tessuto milza.
6. Dopo il completamento del programma del tessuto milza nativa è dissociato in una sospensione splenocyte.
7. Spin down la sospensione a cellule intere, a 300xg a temperatura ambiente per circa 30 sec. Questo farà sì che il rotore e lo statore sono liberati di tutte le cellule che vengono raccolte sul fondo del tubo C.
8. Rimuovere il campione attraverso il setto-sigillato l'apertura del tappo del tubo C con una 1000 pipetter microlitro.

Filtrazione passo

1. Per iniziare la fase di filtrazione, applicare il tessuto dissociato al pre-filtro di separazione o di un colino cellula con 30 micron dimensioni dei pori. Il filtro dovrebbe montare un tubo di 15 ml per 1-2 milza o un tubo da 50 ml per più di 2 milze.
2. Lasciate che la sospensione di cellule passano attraverso. Poi lavare il filtro applicando 5 ml di tampone.
3. Ora, centrifugare la provetta con la sospensione cellulare a 300xg, a temperatura ambiente per 10 minuti per raccogliere tutte splenociti in una milza pellet.
4. Ora, che abbiamo un pellet di splenociti dissociato, dobbiamo aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in una quantità adeguata di buffer.

Dissociazione milza utilizzando il dissociatore gentleMACS produrrà una elevata percentuale di splenociti vitale, che è dimostrato mediante citometria di flusso utilizzando l'analizzatore MACSQuant. Le cellule morte sono colorate con ioduro di propidio. Nell'esempio fornito, l'attaccante scatter plot mostra il lato dot splenociti preparato.

Discussione

Per evitare di dissociazioni manuali ripetitive e spesso dolorosa, il dissociatore gentleMACS permette di dissociare i tessuti in maniera molto efficiente, in condizioni controllate e riproducibili. La procedura di dissociazione tessuto è delicato per le cellule e sospensioni cellulari produce un alto tasso di vitalità. Il dissociatore gentleMACS in combinazione con C Tubi è stata progettata per la preparazione di singola cellula sospensioni da vari tessuti. Lo strumento è dotato di una serie di programmi preimpostati per dissociare il mouse milza, fegato, polmone, o tessuto neurale. La gamma di programmi e protocolli sarà continuamente ampliata per includere altri tessuti.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentleMACS™ Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-093-235	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx
13 mL Tubes	Miltenyi Biotec	130-091-596	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx
autoMACS™ Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx
MACS® BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx
Pre-Separation Filters	Miltenyi Biotec	130-041-407	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx
MACSQuant Analyzer	Miltenyi Biotec	130-092-197
Propidium Iodide Solution	Miltenyi Biotec	130-093-233	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx