Generación de células madre pluripotentes inducidas por reprogramación de fibroblastos humanos con los Lentivirus Stemgent Humanos TF Set

Resumen

Demostramos el protocolo para la generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de células somáticas humanas con lentivirus mediada por la entrega de los factores humanos Oct4, Sox2, Nanog, y Lin28. Pluripotencia fue confirmada por la morfología y la presencia de células madre embrionarias (ES) de células específicas de los marcadores.

Resumen

En 2006, Yamanaka y sus colegas demostraron por primera vez que retrovirus mediada por la entrega y la expresión de Oct4, Sox2, c-Myc y Klf4 es capaz de inducir el estado pluripotente en fibroblastos de ratón. ¹ El mismo grupo también informó de la reprogramación exitosa de las células somáticas humanas en madre pluripotentes inducidas (iPS) utilizando células versiones humanas de los mismos factores de transcripción entregada por vectores retrovirales. ² Por otra parte, James Thomson et al. informaron que el lentivirus mediada por la co-expresión de otra serie de factores (Oct4, Sox2, y Nanog Lin28 ) fue capaz de reprogramar las células somáticas humanas en células iPS. ³

Las células iPS son similares a las células madre embrionarias en la morfología, la proliferación y la capacidad de diferenciarse en todos los tipos de tejidos del cuerpo. Células iPS humanas tienen una clara ventaja sobre células madre embrionarias, ya que muestran las características clave de células madre embrionarias sin el dilema ético de la destrucción de embriones. La generación de pacientes específicos de las células iPS evita un obstáculo importante para las terapias personalizadas medicina regenerativa mediante la eliminación de la posibilidad de rechazo inmunológico no autólogo las células trasplantadas.

Aquí se demuestra el protocolo para la reprogramación de células de fibroblastos humanos con el Stemgent Set Humanos Lentivirus TF. También muestran que las células reprogramadas con este conjunto comienza a mostrar iPS morfología cuatro días después de transducción. Utilizando el Stemolecule Y27632, que hemos seleccionado para las células iPS y la morfología correcta observado después de tres rondas secuenciales de la colonia de la cosecha y pasajes. También demuestran que después de reprogramar las células muestran la pluripotencia marcador de AP, los marcadores de superficie TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, y SSEA-3, y marcadores nucleares Oct4, Sox2 y Nanog.

Protocolo

1. Reprogramación

1. Las células de las semillas BJ a una densidad de 1 x 10 ⁵ células por pocillo de una placa de 6 pocillos. Cultivar las células en 2 ml de medio de cultivo (450 ml EMEM suplementado con 50 ml de FBS ES cualificado, 5 ml de 10 mM no aminoácidos esenciales, 5 ml de penicilina / estreptomicina, 5 ml de 200 mM L-glutamina y 0,9 ml de 55 mM β -mercaptoetanol) durante la noche a 37 ° C y 5% de CO _2.
2. El mismo día, empezar a preparar platos MEF alimentador mediante la adición de 0,1% de gelatina diluida en agua a una placa de 6 pocillos e incubar durante la noche a 37 ° C y CO ₂ al 5%.
3. Después de la incubación, retire medio de las células BJ y añadir 2 ml de medio de cultivo suplementado con 6 mg / ml de polibreno, 500 l hOct4-lentivirus, 50 l hSox2-lentivirus, 50 l hNanog lentivirus y 50 l hLin28 lentivirus-a cada pocillo . Agite suavemente la placa para asegurar una capa uniforme del medio. Incubar toda la noche a 37 ° C y CO ₂ al 5%.
4. El mismo día, eliminar un vial de CF-1 en las células MEF a partir de nitrógeno líquido y descongelación. Retire el líquido de los pozos recubiertos de gelatina (ver paso 1.2) y añadir las células MEF alimentador a una densidad de 0,2 x 10 ⁵ células / pocillo. El volumen total por pozo debe ser 2 ml de células en un medio de crecimiento MEF (450 ml DMEM suplementado con FBS 50 ml y 5 ml no aminoácidos esenciales).
5. Al día siguiente, separar las células BJ con 0,05% de tripsina / EDTA y se centrifuga a 200 xg durante 5 minutos. Aspirar el medio y resuspender en medio de crecimiento. Quitar medio de la placa de alimentación MEF (ver paso 1.4) y añadir 2 ml / pocillo de la suspensión de células BJ. La concentración de células debe ser de aproximadamente 5 x 10 ⁴ células /. Incubar toda la noche a 37 ° C y CO ₂ al 5%.
6. Vuelva a colocar medio 24 horas después de la resiembra con humanos ES / iPS medio de cultivo celular (400 ml DMEM/F12 complementado con 100 ml de suero de reemplazo golpe de gracia, 5 ml de 10 mM no aminoácidos esenciales, 5 ml de 200 mM L-glutamina, 0,9 ml 55 mM β-mercaptoetanol y 20 ng / ml de bFGF recombinante humana). Cambio de medio cada 24 horas durante 7 días.
7. Después de siete días, el cambio medio a medio MEF acondicionado (ver sección 2).

2. Preparación del medio de MEF acondicionado

1. Semilla CF-1 en células alimentadoras MEF 2 x 10 ⁵ células / pocillo en una placa de 6 y medio de crecimiento en 2 ml MEF. Incubar toda la noche a 37 ° C y CO ₂ al 5%.
2. Cambio de medio para la salud humana ES / iPS medio de cultivo celular. Incubar toda la noche a 37 ° C y CO ₂ al 5%.
3. Recoger el líquido sobrenadante cada 24 horas durante cuatro días. Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 micras.
4. Suplemento sobrenadante con 50 ng / ml de bFGF.

3. iPS selección de colonias y pases

1. Seleccione una colonia y como ES-re de semillas en el medio de la cultura humana ES / IPS suplementado con 10 mM de Stemolecule Y27632 en placas de cultivo de células pre-siembra con CF-1 en las células MEF alimentador. Incubar toda la noche a 37 ° C y CO ₂ al 5%.
2. Cambiar el medio de cultivo cada 24 horas durante los primeros siete días (sin complementar con Stemolecule Y27632). Después de siete días, el cambio medio a medio MEF acondicionado (véase la sección 2 de la preparación). Continuamos pases de las células hasta que presentaron la morfología típica madre embrionarias humanas.

4. El examen de inmuno marcadores de pluripotencia

1. Lave suavemente las células tres veces con PBS.
2. Fijar las células con 500 l de solución fijadora durante 20 minutos a temperatura ambiente.
3. Lave suavemente las células tres veces con PBS.
4. Bloquear la unión no específica con 500 l de amortiguación de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente.
5. Se incuban las células con 250 ml del anticuerpo primario específico la noche a 4 ° C (en el ejemplo TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, SSEA-3, Oct4, Sox2, y Nanog Lin28 a 1:100 diluciones).
6. Lave suavemente las células tres veces con PBS.
7. Se incuban las células con 250 l de anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente, manteniéndose alejado de la luz (en el ejemplo de cabra anti-ratón conjugado IgM Cy3, cabra anti-ratón IgG Cy3 conjugado de cabra anti-rata Cy3 IgM conjugado y de cabra anti- conejo Cy3 conjugado a 1:300 diluciones).
8. Lave suavemente las células tres veces con PBS.
9. Añadir DAPI (concentración final de 1 mg / ml) para el último lavado e incubar 5 minutos para visualizar los núcleos.
10. Analizar las células con una lupa.

Parte 5: Resultados de Representante

1. Resultados Morfología:

Fibroblastos de prepucio humano (BJ), las células fueron co-transducidas con Oct4, Sox2, Nanog, y Lin28. Los cambios morfológicos que se observaron a partir del día 4 post-transducción, y el grupo de células se volvieron más apretada en el día 17 (Figura 1). Colonias fueron recogidos manualmente en el día 25 y se cultivaron en CF-1 células alimentadoras MEF. Para facilitar la formación de colonias de células iPS tras la reprogramación, se utilizó Stemolecule Y27632, Un inhibidor de ROCK, para la siembra inicial de la noche en cada paso. colonias de células iPS con buena morfología se observaron después de tres rondas secuenciales de la colonia de la cosecha y pasajes.

2. Expresión de marcadores de pluripotencia:

Para caracterizar mejor las colonias de células iPS aislados, se buscó la presencia de marcadores de pluripotencia común se expresa en células madre embrionarias. Las colonias mostraron una fuerte fosfatasa alcalina (AP) actividad (Figura 2). Además, inmunocitoquímica (CPI) se realizó en las colonias de células iPS con un panel de anticuerpos marcadores específicos de pluripotencia, incluidos los marcadores de la superficie de TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4 y SSEA 3, así como marcadores nucleares Oct4, Sox2 y Nanog. El colonias aisladas iPS fueron positivos para todos los marcadores (Figura 3). Los resultados de la CPI muestran que las células iPS mostró el patrón adecuado pluripotencia expresión de los marcadores, lo que demuestra que estas células iPS se parecen mucho a indiferenciado de células madre embrionarias humanas.

Figura 1: Los cambios morfológicos de las células transducidas BJ. Imágenes brillantes de campo de una colonia de células iPS típico formado en (A) 4 días y (B) 17 días después de la transducción.

Figura 2: La actividad de AP de reprogramar las células BJ. Tres diferentes colonias teñidas con Stemgent Kit de tinción fosfatasa alcalina.

Figura 3: Las células iPS expresan altos niveles de los marcadores de células ES siguientes específicos: los marcadores de superficie TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4 y SSEA-3, y marcadores nucleares de 04 de octubre, Nanog y Sox2.

Discusión

Estos resultados demuestran que la Stemgent Set Humanos Lentivirus TF puede ser utilizado para generar de manera eficiente las colonias de iPS mediante la inducción de la expresión ectópica de transducidas factores de transcripción en fibroblastos humanos. En el diseño de experimentos de reprogramación, las variables se deben considerar varias para optimizar la eficiencia de la reprogramación. En primer lugar, la participación activa de virus al objetivo ratio (multiplicidad de infección MOI) puede ser necesario modificar durante el paso de la transducción de primaria para lograr la eficiencia de transducción óptima. En segundo lugar, las condiciones de crecimiento de las células diana pueden afectar la reprogramación. Las células sanas y proliferantes son más susceptibles a la reprogramación. En tercer lugar, al modificar el protocolo para el número de células diferentes, se recomienda que los números de las células diana se ajustará proporcionalmente a la superficie de la placa de cultivo. Por último, la aplicación de inhibidores de rock como Y27632 deben ser considerados para ayudar a asegurar la reprogramación exitosa ya que estudios recientes han demostrado su utilidad en la mejora de la supervivencia de la colonia hES ^4,5.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human TF Lentivirus Set	Stemgent	00-0005
Stemolecule Y27632	Stemgent	04-0012
TRA-1-81 antibody	Stemgent	09-0012
TRA-1-60 antibody	Stemgent	09-0009
SSEA-4 antibody	Stemgent	09-0003
SSEA-3 antibody	Stemgent	09-0014