Stemgent İnsan TF lentivirüs İnsan Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi ayarla

Özet

Biz, insan faktörleri Oct4, Sox2, Nanog ve Lin28 lentivirüs aracılı teslim kullanarak insan somatik hücre alınan uyarılmış pluripotent kök hücreleri üretimi için protokol göstermektedir. Pluripotency morfolojisi ve embriyonik kök (ES) hücre-spesifik belirteçler varlığı teyit edilmiştir.

Özet

Yamanaka ve arkadaşları 2006 yılında, ilk Oct4, retrovirüs aracılı teslimat ve ifade, Sox2, c-Myc ve Klf4 fare fibroblastlar pluripotent devlet tetikleme kapasitesine sahip olduğunu ^{göstermiştir.} 1 aynı grup aynı zamanda insan somatik hücre başarılı bir şekilde yeniden programlanması halinde rapor başka bir dizi faktöre lentivirüs aracılı co-ifade (Oct4, Sox2, Nanog ve Lin28 retroviral vektörler aynı transkripsiyon faktörleri tarafından teslim insan sürümlerini kullanan bağlı pluripotent kök (iPS) hücreleri, ² Ayrıca, James Thomson ve ark. ) iPS hücreleri içine insan somatik hücre yeniden programlama yeteneğine sahip olan ³

iPS hücreleri morfolojisi, çoğalması ve vücudun tüm doku tiplerine ayırt etme yeteneği ES hücrelere benzer. İnsan iPS hücreleri embriyo imha etik ikilem olmadan ES hücrelerinin temel özellikleri sergilerler ES hücreleri üzerinde ayrı bir avantajı var. Hastaya özgü iPS hücreleri üretimi, kişiselleştirilmiş rejeneratif tıp tedavilere olmayan otolog nakledilen hücrelerin bağışıklık ret potansiyeli ortadan kaldırarak önemli bir barikat circumvents.

Burada Stemgent İnsan TF lentivirüs Set kullanarak insan fibroblast hücreleri yeniden programlama için protokol göstermektedir. Ayrıca bu set ile reprogrammed hücreleri morfolojisi dört gün sonrası transdüksiyon iPS göstermeye başladığını göstermektedir. Stemolecule Y27632 kullanarak, toplama ve koloni üç sıralı mermi Pasajlanması sonra iPS hücreleri ve gözlenen doğru morfolojisi için seçti. Biz de göstermektedir ki hücreleri yeniden programlama pluripotency işaretleyici AP, yüzey belirteçleri TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4 ve SSEA-3, ve nükleer belirteçler Oct4, Sox2 ve Nanog görüntülenir.

Protokol

1. Reprogramming

1. 6 plaka başına 1 x 10 ⁵ hücre yoğunluğu Tohum BJ hücreleri. Kültür hücrelerinin büyüme orta 2 ml (EMEM 450 ml, 50 ml ES nitelikli FBS, 5 ml 10 mM non-esansiyel amino asit, 5 ml penisilin / streptomisin, 5 ml 200 mM L-glutamin ve 0.9 ml 55 mM β ile desteklenmiş 37 o gecede merkaptoetanol) ° C ve% 5 CO _2.
2. Aynı gün, 6 plaka su içinde seyreltilmesi jelatin% 0.1 ve 37 geceleme · C ve% 5 CO ₂ kuluçka ekleyerek MEF besleyici plakaları hazırlanmaya başlayacak.
3. Inkübasyondan sonra, BJ hücrelerden orta kaldırmak ve her iyi polybrene 6 mikrogram / ml tamamlanan 2 ml besi, 500 ul hOct4 lentivirüs, 50 ul hSox2 lentivirüs, 50 ul hNanog lentivirüs ve 50 ul hLin28 lentivirüs ekleyin . Orta hatta kaplama sağlamak için plaka yavaşça sallayın. 37 ° ° C ve% 5 CO ₂ gece inkübe.
4. Aynı gün, 1 şişe sıvı azot ve çözme CF-1 MEF hücrelerinin çıkarın. Jelatin kaplı kuyular (adım 1.2 'ye bakınız) sıvı çıkarın ve 0,2 x 10 ⁵ hücre / iyi bir yoğunluk MEF besleyici hücreler ekleyin. MEF büyüme orta (450 ml DMEM 50 ml FBS ve 5 ml non-esansiyel amino asitleri ile takviye) yanı başına toplam hacmi hücre 2ml olmalıdır.
5. Ertesi gün, 5 dakika boyunca 200 xg'de 0.05% tripsin / EDTA ve santrifüj BJ hücreleri ayırın. Büyüme orta, orta ve tekrar süspansiyon aspire. MEF besleyici plaka (adım 1.4 'e bakınız), orta çıkarın ve 2 ml / BJ hücre süspansiyonu ekleyin. Hücre konsantrasyonu yaklaşık 5 x 10 ⁴ hücre / iyi olmalıdır. 37 ° ° C ve% 5 CO ₂ gece inkübe.
6. Orta 24 saat yeniden tohumlama sonra insan ES / iPS hücre kültürü, orta (DMEM/F12 400 ml, 100 ml Nakavt serum Yedek, 5 ml 10 mM non-esansiyel amino asit, 5 ml 200 mM L-glutamin, 0.9 ml ile takviye ile değiştirin 55 mM β-mercaptoethanol ve 20 ng / ml insan rekombinant bFGF). 7 gün boyunca her 24 saatte bir, orta değiştirin.
7. Yedi gün sonra, MEF klimalı ortamda orta değiştirme (bkz. Bölüm 2).

2. MEF Koşullu Orta hazırlanması

1. Tohum CF-1, 2 x ^{10 5} hücre MEF besleyici hücreler / 2 ml MEF büyüme ortamında 6 plaka üzerinde . 37 ° ° C ve% 5 CO ₂ gece inkübe.
2. Orta ve insan ES / iPS hücre kültür ortamı değiştirin. 37 ° ° C ve% 5 CO ₂ gece inkübe.
3. Dört gün boyunca her 24 saatte bir süpernatant toplayın. 0.22 mikron filtre ile süpernatantı Filtresi.
4. BFGF 50 ng / ml supernatant Ek.

3. iPS Koloni Seçimi ve Pasajlanması

1. CF-1 MEF besleyici hücreler ile hücre kültür yemekleri önceden numaralı seribaşı Stemolecule Y27632 10 mcM ile desteklenmiş insan ES / iPS kültür ortamı ES-benzeri bir koloni ve yeniden tohum seçin. 37 ° ° C ve% 5 CO ₂ gece inkübe.
2. İlk yedi gün (Stemolecule Y27632 ile tamamlayan olmadan) için her 24 saatte bir, orta kültür değiştirin. Yedi gün sonra, MEF klimalı ortamda orta değiştirmek (hazırlık için bölüm 2'ye bakınız). Tipik bir insan ES morfolojisi gösterdi kadar hücreleri Pasajlanması devam etti.

4. Pluripotency Belirteçleri İmmünositokimyasal Sınav

1. Hücreler PBS ile hafifçe üç kez yıkayın.
2. 500 oda sıcaklığında 20 dakika fiksatif ul hücreleri sabitleyin.
3. Hücreler PBS ile hafifçe üç kez yıkayın.
4. Oda sıcaklığında bir saat için 500 ul engelleme tampon ile non-spesifik bağlama engelleyin.
5. 4 geceleme birincil antikor ile 250 ul hücreleri ° C'de (1:100 TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, SSEA-3, Oct4, Sox2, Nanog ve Lin28 dilüsyonları).
6. Hücreler PBS ile hafifçe üç kez yıkayın.
7. (Anti-fare IgG Cy3 konjuge, Keçi anti-fare IgG Cy3 konjuge keçi anti-Sıçan IgM Cy3 konjuge ve keçi anti-Keçi kullanılan ışıktan uzak tutarak, hücrelerin oda sıcaklığında 1 saat süreyle 250 ul ikincil antikor ile inkübe Tavşan Cy3 konjuge) 1:300 dilüsyonları.
8. Hücreler PBS ile hafifçe üç kez yıkayın.
9. Son yıkama DAPI (son konsantrasyonu 1 mcg / ml) ve çekirdekleri görselleştirmek için 5 dakika inkübe edin.
10. Büyütme altında hücrelerin analiz edin.

Bölüm 5: Temsilci Sonuçlar

1. Morfoloji Sonuçlar:

İnsan sünnet derisi fibroblast (BJ) hücreleri, Sox2, Nanog ve Lin28 Oct4 birlikte transduced. Günde 4 post-transdüksiyon gibi erken morfolojik değişiklikler gözlenir ve hücre kümesi daha sıkı gün 17 (Şekil 1) dolu oldu. Kolonileri 25 gün elle aldı ve CF-1 MEF besleyici hücreler kültüre edildi. IPS hücrenin yeniden programlanması sonra koloni oluşumunu kolaylaştırmak için, biz Stemolecule Y27632ROCK inhibitörü, her geçiş sırasında ilk gecede tohumlama için. iyi morfolojisi iPS hücre kolonileri koloni üç sıralı mermi toplama ve Pasajlanması sonra gözlendi.

2. Pluripotency Markers İfade:

Izole iPS hücre kolonileri karakterize etmek için, biz ES hücrelerinin ifade ortak pluripotency belirteçlerin varlığı için baktı. Koloniler güçlü alkalin fosfataz (AP) aktivitesi (Şekil 2) sergiledi. Ayrıca, immünsitokimya (ICC) yüzey belirteçleri TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4 ve SSEA-3 gibi nükleer belirteçlerinin de dahil olmak üzere, pluripotency marker spesifik antikorların bir panel ile iPS hücre kolonileri yapıldı Oct4, Sox2 ve Nanog. Izole iPS koloniler Tüm göstergeler için pozitif (Şekil 3). ICC sonuçları iPS hücreleri bu iPS hücreleri farklılaşmamış insan ES hücreleri yakından benzediği gösteren uygun pluripotency işaretleyici ifade desenini ortaya koyduğu göstermektedir.

Şekil 1: Morfolojik değişiklikler BJ hücreleri transduced. Aydınlık alan görüntüleri, tipik bir iPS hücre kolonisinin (A) 4 gün ve (B) 17 gün sonrası transdüksiyon kurdu.

Şekil 2: AP reprogrammed BJ hücreleri aktivite. Üç farklı koloniler Stemgent Alkalin Fosfataz Boyama Seti ile boyandı.

Şekil 3: yüzey belirteçleri TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4 ve SSEA-3, ve nükleer belirteçler Eki 4, Nanog ve Sox2: İnsan iPS hücreleri aşağıdaki ES hücre spesifik belirteçler yüksek düzeyde ifade.

Tartışmalar

Bu sonuçlar, insan fibroblastlarında transkripsiyon faktörleri transduced Stemgent İnsan TF lentivirüs Set verimli ektopik ifade uyararak iPS koloniler oluşturmak için kullanılabilir olduğunu göstermektedir. Reprogramming deneyler tasarlarken, çok değişkenli reprogramming verimliliği optimize etmek için düşünülmelidir. İlk olarak, aktif virüs hedef oranı (enfeksiyon, İçişleri Bakanlığı, çokluk) optimum transduction verim elde etmek için birincil transdüksiyon adım sırasında değiştirilmesi gerekir. İkinci olarak, hedef hücrelerin büyüme durumu yeniden programlama etkileyebilir. Sağlıklı ve proliferatif hücreleri yeniden programlama için daha müsait. Üçüncü olarak, farklı hücre numaraları için protokol değiştirerek, hedef hücre numaraları kültür çanak yüzey alanı ile orantılı ayarlanabilir olması tavsiye edilir. Son olarak, son çalışmaların artırılması embriyonik kök koloni hayatta kalma kendi programını gösterdiği gibi, başarılı bir yeniden programlama yardımcı olmak için ROCK inhibitörleri gibi Y27632 başvurusu dikkate alınması ^gerekir. 4,5

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human TF Lentivirus Set	Stemgent	00-0005
Stemolecule Y27632	Stemgent	04-0012
TRA-1-81 antibody	Stemgent	09-0012
TRA-1-60 antibody	Stemgent	09-0009
SSEA-4 antibody	Stemgent	09-0003
SSEA-3 antibody	Stemgent	09-0014