Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки путем перепрограммирования человеческих фибробластов с Stemgent правам лентивирус TF Установить

Резюме

Мы демонстрируем протокол для поколения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из человеческих соматических клеток использованием лентивирусов-опосредованной доставки человеческих факторов Oct4, Sox2, Nanog и Lin28. Плюрипотентности было подтверждено морфологии и наличие эмбриональных стволовых (ЭС) клетки-специфических маркеров.

Аннотация

В 2006 году Яманака и его коллеги впервые продемонстрировали, что ретровирус-опосредованного доставки и экспрессии Oct4, Sox2, с-Myc и Klf4 способен вызывать плюрипотентных государства в мышиных фибробластов. ¹ той же группе также сообщили об успешном перепрограммирования соматических клетках человека в индуцированных плюрипотентных стволовых (IPS) клеток с использованием человеческих версий одного и того же фактора транскрипции выступил ретровирусных векторов. ² Кроме того, Джеймс Томсон и соавт. сообщили, что лентивирус-опосредованной коэкспрессией другой набор факторов (Oct4, Sox2, Nanog и Lin28 ) был способен перепрограммирования соматических клетках человека в плюрипотентных клеток. ³

плюрипотентных клетках похожи на стволовые клетки в морфологии, распространения и способностью дифференцироваться во все типы тканей организма. В клетках человека плюрипотентных имеют явное преимущество перед ЭС клетки, как они проявляют основные свойства ЭС клеток без этической дилеммой зародыш разрушения. Поколение конкретного пациента клетки плюрипотентных обход важных контрольно-пропускной пункт к персонализированной медицине регенеративной терапии за счет устранения возможности иммунного отторжения не-аутологичных пересаженных клеток.

Здесь показано, протокол для перепрограммирования человеческих клеток фибробластов использованием Stemgent правам лентивирус TF Set. Мы также показываем, что клетки, перепрограммировать с этим набором начинают проявлять плюрипотентных морфологии четыре дня после трансдукции. Использование Stemolecule Y27632, мы выбрали для плюрипотентных клеток и наблюдается правильная морфология после трех последовательных раундов колонии сбор и пассажей. Мы также показали, что после перепрограммирования клетки отображается маркером плюрипотентности А.П., поверхностные маркеры TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4 и SSEA-3, и ядерных маркеров Oct4, Sox2 и Nanog.

протокол

1. Перепрограммирование

1. Семенной BJ клеток при плотности 1 х 10 ^{5 клеток} на лунку 6-луночный планшет. Культуры клеток в 2 мл ростовой среды (450 мл EMEM дополнена с 50 мл ES квалифицированных ФБС, 5 мл 10 мМ без незаменимых аминокислот, 5 мл пенициллина / стрептомицина, 5 мл 200 мМ L-глютамина и 0,9 мл 55 мМ β -меркаптоэтанол) в течение ночи при температуре 37 ° С и 5% СО _2.
2. В тот же день, начать подготовку пластин MEF подачи, добавив 0,1% желатина, разбавленным водой в 6 ячейках и инкубации в течение ночи при 37 ° С и 5% СО _2.
3. После инкубации удалите среды от BJ клеток и добавить 2 мл питательной среде с 6 мкг / мл polybrene, 500 мкл hOct4-лентивирус, 50 ​​мкл hSox2-лентивирус, 50 ​​мкл hNanog-лентивирус и 50 мкл hLin28-лентивирус в каждую лунку . Осторожно пластины для обеспечения даже покрытие среды. Выдержите в течение ночи при 37 ° С и 5% СО _2.
4. В тот же день, удалите 1 флакон CF-1 клеток MEF из жидкого азота и оттепель. Удалите жидкость с желатином лунок (см. шаг 1.2) и добавления ячеек MEF подачи при плотности 0,2 × 10 ⁵ клеток / лунку. Общий объем одной скважины должно быть 2 мл клеток в питательную среду MEF (450 мл DMEM дополнена с 50 мл ФБС и 5 мл без незаменимых аминокислот).
5. На следующий день, отделить BJ клеток с 0,05% трипсин / ЭДТА и центрифуге при 200 мкг в течение 5 минут. Аспирируйте средних и ресуспендируют в ростовой среде. Удаление среды из пластины MEF подачи (см. п. 1.4) и добавьте 2 мл / лунку BJ клеточной суспензии. Концентрации клеток должна быть примерно 5 х 10 ^{4 клеток} / лунку. Выдержите в течение ночи при 37 ° С и 5% СО _2.
6. Замените среду 24 часов после повторного посева с человеческими ES / IPS культуре клеток средой (400 мл DMEM/F12 дополнен 100 мл сыворотки Нокаут Замена, 5 мл 10 мМ без незаменимых аминокислот, 5 мл 200 мМ L-глутамина, 0,9 мл 55 мМ β-меркаптоэтанола и 20 нг / мл человеческий рекомбинантный bFGF). Изменение среды каждые 24 часов в течение 7 дней.
7. После семи дней, изменение средних MEF кондиционированной среды (см. раздел 2).

2. Подготовка MEF кондиционированной среды

1. Семенной CF-1 MEF фидерных клеток на 2 х 10 ⁵ клеток / лунку на 6 лунками в 2 мл среды роста MEF. Выдержите в течение ночи при 37 ° С и 5% СО _2.
2. Изменение среднего человека ES / IPS культуральной среды клеток. Выдержите в течение ночи при 37 ° С и 5% СО _2.
3. Сбор супернатант каждые 24 часов в течение четырех дней. Фильтры супернатанта через фильтр 0,22 мкм.
4. Дополнение супернатант с 50 нг / мл bFGF.

3. плюрипотентных Выбор колонии и пассажи

1. Выберите ES-подобные колонии и вновь семя в человека ES / IPS питательной среде с добавлением 10 мкМ Stemolecule Y27632 на культуре клеток блюда предварительно отобранный с МВ-1 клеток MEF подачи. Выдержите в течение ночи при 37 ° С и 5% СО _2.
2. Изменение культуральной среды через каждые 24 часов в течение первых семи дней (без дополняя Stemolecule Y27632). После семи дней, изменение средних MEF кондиционированной среды (см. раздел 2 для подготовки). Мы продолжали пассирования клетки, пока они не показали типичной морфологии человека ES.

4. Иммуноцитохимическая Экспертиза плюрипотентности Маркеры

1. Вымойте клетки мягко три раза PBS.
2. Fix клеток с 500 мкл фиксатором в течение 20 минут при комнатной температуре.
3. Вымойте клетки мягко три раза PBS.
4. Блок неспецифического связывания с 500 мкл блокирующего буфера в течение одного часа при комнатной температуре.
5. Инкубируйте клетки с 250 мкл конкретных первичных антител в течение ночи при 4 ° С (мы использовали TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, SSEA-3, Oct4, Sox2, Nanog и Lin28 на 1:100 разведениях).
6. Вымойте клетки мягко три раза PBS.
7. Инкубируйте клетки с 250 мкл вторичными антителами в течение 1 часа при комнатной температуре, держась подальше от света (мы использовали антимышиного IgM Cy3 сопряжены, антимышиного IgG Cy3 сопряжены, козий анти-IgM крысы Cy3 сопряженной и козьего анти- Кролик Cy3 сопряженных в разведении 1:300).
8. Вымойте клетки мягко три раза PBS.
9. Добавить DAPI (конечная концентрация 1 мкг / мл) до последнего мыть и инкубировать 5 минут для визуализации ядер.
10. Анализ клетки под увеличением.

Часть 5: Представитель Результаты

1. Морфология Результаты:

Человек фибробластов крайней плоти (BJ) клетки совместно с трансдуцированных Oct4, Sox2, Nanog и Lin28. Морфологические изменения наблюдались уже в 4-й день после трансдукции, и кластер клетки стали более плотно упакованы в день 17 (рис. 1). Колонии были вручную выбрал в день 25 и культивировали на CF-1 клеток MEF подачи. Для облегчения колонии плюрипотентных образования клеток после перепрограммирования, мы использовали Stemolecule Y27632, ROCK ингибитор, для первоначального посева ночь во время каждого прохода. плюрипотентных клеточных колоний с хорошей морфологией наблюдались после трех последовательных раундов колонии сбор и пассажей.

2. Экспрессия маркеров плюрипотентности:

Для дальнейшего характеризуют изолированной камере плюрипотентных колоний, мы смотрели на наличие общих маркеров плюрипотентности выражается в ЭС клетки. Колонии выставлены сильные щелочной фосфатазы (AP) деятельности (рис. 2). Кроме того, иммуноцитохимия (МУС) был выполнен на колоний плюрипотентных ячейки с панели маркеров плюрипотентности-специфических антител, в том числе поверхностные маркеры TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4 и SSEA-3, а также ядерных маркеров Oct4, Sox2 и Nanog. Изолированных колоний плюрипотентных были положительными для всех маркеров (рис. 3). ICC результаты показывают, что плюрипотентных клетках выставлены соответствующие плюрипотентности выражению маркер, демонстрируя, что эти плюрипотентных клетках напоминают недифференцированные клетки человека ES.

Рисунок 1: Морфологические изменения трансдуцированных BJ клеток. Яркие образы области типичной колонией ячейки плюрипотентных образуются при () 4 дня и (Б) 17 дней после трансдукции.

Рисунок 2: AP деятельности перепрограммировать BJ клеток. Три различных колонии окрашивали Stemgent щелочные Kit Окрашивание фосфатазы.

Рисунок 3: клетки человека плюрипотентных выразить высокие уровни следующих ЭСК специфических маркеров: поверхностные маркеры TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4 и SSEA-3, и ядерных маркеров 4 октября, Nanog и Sox2.

Обсуждение

Эти результаты показывают, что Stemgent правам лентивирус TF Установить может быть использована для эффективной генерации плюрипотентных колонии, вызывая внематочной выражение трансдуцированных транскрипционных факторов в человеческих фибробластов. При проектировании перепрограммирования экспериментов, несколько переменных следует рассматривать оптимизировать эффективность перепрограммирования. Во-первых, активный вирус до цели отношение (множественность заражения МВД), возможно, должны быть изменены во время первого шага трансдукции для достижения оптимальной эффективности трансдукции. Во-вторых, условием роста клеток-мишеней может повлиять на перепрограммирование. Здоровые и пролиферативные клетки более восприимчивыми к перепрограммированию. В-третьих, при изменении протокола для разных номеров ячейки, рекомендуется, что числа клеток-мишеней быть скорректирована пропорционально площади поверхности культуры блюдо. Наконец, применяя ROCK ингибиторы, такие как Y27632 следует рассматривать, чтобы обеспечить успешное перепрограммирование как показали недавние исследования показали его полезность для повышения выживаемости колонии ЭСК. ^4,5

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human TF Lentivirus Set	Stemgent	00-0005
Stemolecule Y27632	Stemgent	04-0012
TRA-1-81 antibody	Stemgent	09-0012
TRA-1-60 antibody	Stemgent	09-0009
SSEA-4 antibody	Stemgent	09-0003
SSEA-3 antibody	Stemgent	09-0014