Génération de cellules souches pluripotentes induites par la reprogrammation des fibroblastes humains avec les lentivirus TF Stemgent Homme Set

Résumé

Nous démontrons le protocole pour la génération de cellules souches pluripotentes induites à partir des cellules somatiques humaines en utilisant des lentivirus médiée par la livraison des facteurs humains Oct4, Sox2, Nanog, et Lin28. Pluripotence a été confirmée par la morphologie et la présence de cellules souches embryonnaires (ES) de cellules de marqueurs spécifiques.

Résumé

En 2006, Yamanaka et ses collègues ont d'abord démontré que des rétrovirus médiation de livraison et d'expression de Oct4, Sox2, c-Myc et Klf4 est capable d'induire l'état pluripotent dans des fibroblastes de souris. ¹ Le même groupe a également signalé la reprogrammation réussie de cellules somatiques humaines dans les souches pluripotentes induites (iPS) en utilisant des versions humaines des facteurs de transcription mêmes livrés par des vecteurs rétroviraux. ^{2 En} outre, James Thomson et al. signalé que les lentivirus médiée par la co-expression d'un autre ensemble de facteurs (Oct4, Sox2, Nanog et Lin28 ) a été capable de reprogrammer des cellules somatiques humaines en cellules iPS. ³

Les cellules iPS sont similaires aux cellules ES dans la morphologie, la prolifération et la capacité de se différencier en tous types de tissus du corps. Cellules iPS humaines ont un net avantage sur les cellules ES comme ils présentent des propriétés clés des cellules ES sans le dilemme éthique de la destruction d'embryons. La génération de cellules iPS spécifiques au patient contourne un barrage important de personnaliser les thérapies en médecine régénérative, en éliminant le risque de rejet immunitaire de la non-autologues cellules transplantées.

Ici nous démontrons le protocole pour la reprogrammation des cellules de fibroblastes humains en utilisant les Stemgent Set homme Lentivirus TF. Nous montrons aussi que les cellules reprogrammées avec cet ensemble commencent à montrer des iPS morphologie quatre jours après la transduction. Utilisation de la Y27632 Stemolecule, nous avons sélectionné pour les cellules iPS et observé la morphologie correcte après trois cycles séquentiels de la colonie de la cueillette et repiquage. Nous démontrons également que, après reprogrammation des cellules affiché le marqueur AP pluripotence, les marqueurs de surface TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, et SSEA-3, et des marqueurs nucléaires Oct4, Sox2 et Nanog.

Protocole

1. Reprogrammation

1. Cellules BJ semences à une densité de 1 x 10 ⁵ cellules par puits d'une plaque à 6 puits. Culture des cellules dans 2 ml de milieu de croissance (450 ml EMEM supplémenté avec 50 ml de FBS ES qualifié, 5 ml 10 mM non acides aminés essentiels, 5 ml de pénicilline / streptomycine, 5 ml de 200 mM de L-glutamine et 0,9 ml β 55 mm -mercaptoéthanol) nuit à 37 ° C et 5% de CO _2.
2. Le même jour, commencer à préparer les plaques d'alimentation du MEF en ajoutant 0,1% de gélatine diluée dans de l'eau sur une plaque de 6 puits et incuber pendant une nuit à 37 ° C et CO ₂ 5%.
3. Après incubation, éliminer le milieu à partir des cellules BJ et ajouter 2 ml milieu de croissance complété avec 6 pg / ml de polybrène, 500 ul hOct4-lentivirus, 50 ul hSox2-lentivirus, 50 ul hNanog-lentivirus et 50 pi hLin28-lentivirus dans chaque puits . Secouez doucement la plaque pour assurer un revêtement uniforme du milieu. Incuber une nuit à 37 ° C et CO ₂ 5%.
4. Le même jour, enlever 1 flacon de cellules MEF FC-1 de l'azote liquide et de dégel. Retirer le liquide des puits de gélatine enduit (voir étape 1.2) et ajouter des cellules nourricières du MEF à une densité de 0,2 x 10 ⁵ cellules / puits. Le volume total par puits devrait être 2ml de cellules dans un milieu de croissance du MEF (450 ml de DMEM supplémenté avec 50 FBS ml et 5 ml non acides aminés essentiels).
5. Le lendemain, détachez les cellules BJ avec 0,05% de trypsine / EDTA et centrifuger à 200 xg pendant 5 minutes. Aspirer le moyen et remettre en suspension dans un milieu de croissance. Retirer de la plaque de support chargeur de MEF (voir étape 1.4) et ajouter 2 ml / puits de la suspension cellulaire BJ. La concentration des cellules devraient être d'environ 5 x 10 ⁴ cellules / puits. Incuber une nuit à 37 ° C et CO ₂ 5%.
6. Remplacer moyenne 24 heures après le réensemencement avec des humains ES / IPS milieu de culture cellulaire (400 ml DMEM/F12 supplémenté avec 100 ml de sérum de remplacement Knockout, 5 ml 10 mM non acides aminés essentiels, 5 ml de 200 mM de L-glutamine, 0,9 ml 55 mM β-mercaptoéthanol et 20 ng / ml de bFGF humain recombinant). Changer moyenne toutes les 24 heures pendant 7 jours.
7. Après sept jours, le changement moyen du MEF milieu conditionné (voir section 2).

2. Préparation du MEF milieu conditionné

1. Graine FC-1 des cellules nourricières du MEF à 2 x 10 ⁵ cellules / puits sur une plaque à 6 puits dans 2 ml de milieu de croissance du MEF. Incuber une nuit à 37 ° C et CO ₂ 5%.
2. Changement moyen humaines ES / IPS milieu de culture cellulaire. Incuber une nuit à 37 ° C et CO ₂ 5%.
3. Recueillir le surnageant toutes les 24 heures pendant quatre jours. Filtrer le surnageant à travers un filtre de 0,22 um.
4. Supplément surnageant avec 50 ng / ml de bFGF.

3. Sélection Colony iPS et repiquage

1. Sélectionnez une colonie ES-like et réensemencer en milieu de culture humaine ES / IPS complété avec 10 pM de Stemolecule Y27632 sur des boîtes de culture de cellules pré-ensemencés avec des CF-1 des cellules nourricières du MEF. Incuber une nuit à 37 ° C et CO ₂ 5%.
2. Changer le milieu de culture toutes les 24 heures pour les sept premiers jours (sans complétant avec Stemolecule Y27632). Après sept jours, le changement moyen du MEF milieu conditionné (voir section 2 pour la préparation). Nous avons continué repiquage des cellules jusqu'à ce qu'elles montrent la morphologie typique ES humaines.

4. Examen des marqueurs immunocytochimiques pluripotence

1. Lavez délicatement les cellules trois fois avec PBS.
2. Fixer les cellules avec 500 pi de fixateur pendant 20 minutes à température ambiante.
3. Lavez délicatement les cellules trois fois avec PBS.
4. Bloc de fixation non spécifique avec 500 ul du tampon de blocage pendant une heure à température ambiante.
5. Incuber les cellules avec 250 pi de l'anticorps primaire spécifique nuit à 4 ° C (nous avons utilisé TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, SSEA-3, Oct4, Sox2, Nanog et Lin28 au 1:100 dilutions).
6. Lavez délicatement les cellules trois fois avec PBS.
7. Incuber les cellules avec 250 pi d'anticorps secondaire pendant 1 heure à température ambiante, en gardant loin de la lumière (nous avons utilisé chèvre anti-souris conjugué IgM Cy3, de chèvre anti-IgG de souris conjugué Cy3, chèvre anti-rat IgM Cy3 conjugué et de chèvre anti- Lapin Cy3 conjugué au 1:300 dilutions).
8. Lavez délicatement les cellules trois fois avec PBS.
9. Ajouter DAPI (concentration finale 1 ug / ml) pour le dernier lavage et incuber 5 minutes à visualiser les noyaux.
10. Analyser les cellules sous grossissement.

Partie 5: Résultats Représentant

1. Résultats Morphologie:

L'homme le prépuce fibroblastes (BJ), les cellules ont été co-transduites avec Oct4, Sox2, Nanog, et Lin28. Les modifications morphologiques ont été observées dès le jour 4 post-transduction, et les amas de cellules sont devenues plus serrées au jour 17 (figure 1). Des colonies ont été cueillis à la main 25 jours et cultivés sur FC-1 des cellules nourricières du MEF. Afin de faciliter la formation iPS colonie cellulaire après reprogrammation, nous avons utilisé Stemolecule Y27632, Un inhibiteur de ROCK, pour l'ensemencement initial nuit lors de chaque passage. colonies de cellules iPS avec une bonne morphologie ont été observées après trois cycles séquentiels de la colonie de la cueillette et repiquage.

2. Expression de marqueurs pluripotence:

Afin de mieux caractériser les cellules iPS colonies isolées, nous avons examiné pour la présence de marqueurs communs pluripotence exprimé dans les cellules ES. Les colonies présentaient une forte phosphatase alcaline (AP) activité (figure 2). Par ailleurs, l'immunocytochimie (ICC) a été réalisée sur les colonies de cellules iPS avec un panel d'anticorps marqueurs spécifiques pluripotence, y compris les marqueurs de surface TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4 et SSEA-3 ainsi que des marqueurs nucléaires Oct4, Sox2 et Nanog. Les colonies isolées iPS ont été positifs pour tous les marqueurs (figure 3). Les résultats de la CPI montrent que les cellules iPS exposées du motif de la pluripotence appropriée l'expression du marqueur, ce qui démontre que ces cellules iPS ressemblent indifférencié des cellules ES humaines.

Figure 1: Les modifications morphologiques des cellules transduites BJ. Images en champ clair d'une colonie de cellules iPS typiques formé en (A) 4 jours et (B) 17 jours après la transduction.

Figure 2: Activité de l'AP reprogrammé les cellules BJ. Trois différentes colonies colorées à Stemgent Kit Phosphatase Alcaline coloration.

Figure 3: Les cellules iPS humaines expriment des niveaux élevés des marqueurs de cellules ES suivantes spécifiques: les marqueurs de surface TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4 et SSEA-3, et des marqueurs nucléaires 4 oct. Nanog et Sox2.

Discussion

Ces résultats démontrent que l'homme Stemgent Set Lentivirus TF peut être utilisé pour générer efficacement des colonies iPS en induisant l'expression ectopique de transduction des facteurs de transcription dans des fibroblastes humains. Lors de la conception des expériences de reprogrammation, plusieurs variables doivent être considérés afin d'optimiser l'efficacité de la reprogrammation. Premièrement, le virus de l'actif à objectif de ratio (multiplicité d'infection MOI) peuvent avoir besoin d'être modifiés durant l'étape de la transduction du primaire à atteindre une efficacité optimale de transduction. Deuxièmement, la condition de croissance des cellules cibles peuvent avoir un impact reprogrammation. Les cellules saines et proliférative se prêtent davantage à une reprogrammation. Troisièmement, lors de la modification du protocole pour le nombre de cellules différentes, il est recommandé que le nombre de cellules cibles être ajustée proportionnellement à la surface de la boîte de culture. Enfin, les inhibiteurs de ROCK application tels que Y27632 devrait être considérée pour aider à assurer reprogrammation de succès que des études récentes ont démontré son utilité dans l'amélioration de la survie des colonies hES ^4,5.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human TF Lentivirus Set	Stemgent	00-0005
Stemolecule Y27632	Stemgent	04-0012
TRA-1-81 antibody	Stemgent	09-0012
TRA-1-60 antibody	Stemgent	09-0009
SSEA-4 antibody	Stemgent	09-0003
SSEA-3 antibody	Stemgent	09-0014