Las respuestas de los análisis de las neuronas sensoriales olfativas ratón Utilizando la grabación Electroolfactogram Aire fase

Resumen

El electroolfactogram (EOG) de grabación es una manera informativa, fácil de realizar, y fiable para evaluar la función olfatoria a nivel del epitelio olfativo. Este protocolo describe un sistema de grabación, preparación de los tejidos del ratón, la recopilación de datos y análisis de datos básicos.

Resumen

Los animales dependen del olfato para muchos comportamientos críticos, como la búsqueda de fuentes de alimento, evitar a los depredadores, y la identificación de su misma especie para aparearse y otras interacciones sociales. El electroolfactogram (EOG) de grabación es un método informativo, fácil de realizar, y confiable de la función olfatoria de ensayo a nivel del epitelio olfativo. Desde la descripción de 1956 de la EOG por Ottoson en las ranas ^1, el registro EOG se ha aplicado en muchos vertebrados como las salamandras, conejos, ratas, ratones y seres humanos (revisado por Scott y Scott-Johnson, 2002, ref. 2). Los recientes avances en la modificación genética en ratones han reavivado el interés en la grabación de la EOG para la caracterización fisiológica de la función olfatoria en el knock-out y knock-en ratones. EOG grabaciones se han aplicado con éxito para demostrar el papel central de los componentes de transducción de señales olfativas ^3-8, y más recientemente para caracterizar la contribución de ciertos mecanismos de regulación de las respuestas OSN ^09.12.

Detección de olor se produce en la superficie del epitelio olfatorio en los cilios de la OSN, donde una cascada de transducción de señales conduce a la apertura de los canales iónicos, lo que genera una corriente que fluye hacia los cilios y despolarización de la membrana ^13. La EOG es el potencial negativo registrado extracelularmente en la superficie del epitelio olfativo a la estimulación de olor, como resultado de la suma de los posibles cambios causados ​​por cada OSN de respuesta en el campo de la grabación ^2. La comparación de la amplitud y la cinética de la EOG así información valiosa sobre la modificación genética y otras manipulaciones experimentales influyen en la señalización moleculares que subyacen a la respuesta a la OSN olor.

A continuación se describe una grabación EOG aire en una fase de preparación de los cornetes ratón olfativo. En pocas palabras, tras sacrificar a los ratones, los cornetes olfativas son expuestos por la cabeza que divide a lo largo de la línea media y la eliminación del tabique. La preparación de los cornetes se coloca en la configuración de la grabación, y un electrodo de registro se coloca en la superficie del epitelio olfatorio en uno de los cornetes medial. Un electrodo de referencia está conectado eléctricamente con el tejido a través de una solución tampón. Un flujo continuo de aire húmedo se sopla sobre la superficie del epitelio para mantenerlo húmedo. El vapor de las soluciones de olor se dispersa en el flujo de aire húmedo para estimular el epitelio. Las respuestas son grabadas y digitalizadas para su posterior análisis.

Protocolo

Parte 1. La grabación EOG configuración

El aparato de grabación consiste en un electrodo de registro, electrodo de referencia, el tubo de suministro de aire, la etapa de muestras, y el microscopio de disección, todos anclados en una mesa de aire dentro de una jaula de Faraday. Micromanipulador se utilizan para la colocación de los electrodos y el tubo de suministro de aire. Un flujo continuo de aire se hace pasar por agua destilada para añadir humedad antes de pasar por el tubo de aire y sobre la muestra. Un plato de cultivo de 60 mm llena de Sylgard a una profundidad de 8.6 mm se utiliza como superficie de montaje de la muestra. Un pozo y un canal están excavadas en la Sylgard en el plato de montaje para proporcionar un medio para conectar eléctricamente el electrodo de referencia de la muestra a través de la solución de Ringer modificada.

El electrodo de registro y el electrodo de referencia se conecta a un amplificador. Las señales de que el amplificador se envían a un digitalizador y luego a una computadora. Software como Axograph o pCLAMP se puede utilizar para controlar el protocolo de estimulación, para grabar la señal, y para su posterior análisis de las respuestas. Un osciloscopio conectado después de que el amplificador puede ser conveniente para monitoreo en tiempo real del potencial eléctrico al colocar el electrodo de registro y durante las grabaciones EOG.

La entrega de los estímulos de olor es controlado por un Picospritzer, que se conecta al mismo equipo utilizado para la adquisición de la señal. La presión de aire en el Picospritzer se establece en 10 psi. Un tanque de aire y el regulador solo se puede utilizar para suministrar aire a la tabla de aire y la Picospritzer. Un segundo tanque de aire y el regulador se utiliza para proporcionar aire para el flujo de aire húmedo, ya que esto requiere una presión más baja y una gran cantidad de flujo de aire. Justo antes de la entrega de un estímulo de olor, la salida Picospritzer está conectado a una botella de olor. La botella de olor se conecta al tubo de suministro de aire.

Parte 2: Preparación de electrodos

El electrodo de registro es un alambre de plata cloruradas en un vaso capilar sacó llena con solución de Ringer modificadas (135 mM NaCl, 5 KCl, 1 mM CaCl _2, 1,5 mM _MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7,4, esterilizada por filtración). El electrodo de referencia es un hilo de plata cloruradas.

1. Instalar alambre de plata en el soporte de los electrodos. Para el electrodo de registro, uno a dos centímetros de alambre que sobresalen del extremo del soporte de los electrodos. Más de alambre se puede dejar para el electrodo de referencia.
2. Para añadir la capa de AgCl que el alambre de plata, la posición del cable en 0,1 M NaCl y conectar el soporte del electrodo al polo positivo de una fuente de 1.5 a 9 V de corriente continua. El polo negativo de la fuente de alimentación debe estar conectado eléctricamente a la solución 0,1 M de NaCl. Permitir que la reacción chloriding proceder durante 10 minutos. Para igualar la energía estática entre la grabación y el electrodo de referencia, brevemente los electrodos juntos antes de instalarlas en el aparato de grabación.
3. Tirar un vaso capilar mediante un extractor de micropipeta. La abertura en la punta del capilar debe ser alrededor de 5-10 micrones de diámetro.
4. Use un lápiz de diamante para marcar y romper el extremo romo de los capilares por lo que es de ~ 2 cm más largo que el alambre de plata. Fuego pulir el corte final con la antorcha de butano.
5. Derretir el 0,5% de agarosa en una solución de Ringer modificada. Tirar de una pequeña cantidad de solución de agarosa fundida en la punta del electrodo con una pipeta de transferencia.
6. Llenar el capilar retiró aproximadamente 1 / 2 de la forma con la solución de Ringer modificada (una jeringa que se ha calentado y sacó a tener un final largo y fino es útil para este propósito). Agitar suavemente el tubo capilar para eliminar burbujas de aire. Guarde el electrodo lleno en el frasco de almacenamiento con una pequeña cantidad de solución de Ringer modificada en la parte inferior hasta que están listos para ser utilizados. Una vez que una muestra de tejido está preparado y listo para grabar, instalar un capilar lleno sobre el alambre electrodo de registro.

Parte 3: Preparación de las soluciones de olor

El acetato de amilo olores y evocar respuestas heptaldehyde grande y por lo tanto son opciones buenas como estimulantes EOG.

1. En tubos de microcentrífuga, preparar una serie de diluciones de olor en dimetilsulfóxido (DMSO). Como punto de partida para una curva dosis-respuesta, preparar diluciones de 10 veces a partir de 5 M a 5 x 10 ^-6 M. Hacer diluciones frescas cada día.
2. Volver a diluir los olores de 50 veces en el agua mediante la mezcla de 100 acciones diluidas l en DMSO con 4,9 ml de agua en 2 botellas con tapones de silicona oz. Deje que las soluciones se equilibran en las botellas, por lo menos 30 minutos. Tenga en cuenta que la concentración de vapor de sustancias odoríferas en cada botella se desconoce, pero puede variar en función de la concentración de olores en la fase líquida.
3. Insertar dos agujas de calibre 18 a través del tapón de silicona para proveer puertos de entrada y de salida. Los puertos deben estar conectados cuando la botella no está en uso.

Parte 4: Registro de los datos y el análisis de EOG

1. Sacrificio de un ratón de CO ₂ la eutanasia o la sobredosis de anestesia seguido por decapitación. Quitar la piel que recubre el cráneo y sagital dividir en dos la cabeza a lo largo de la línea media.
2. Monte de la mitad de la cabeza, cara medial hacia arriba, sobre el plato de montaje. Retire con cuidado el tabique para exponer los cornetes.
3. Coloque el plato con el tejido montado en la etapa de grabación. Alinear el escenario para que el lugar de grabación en los cornetes se centra en el microscopio.
4. A su vez en el tanque de aire para proporcionar aire húmedo a la superficie de los cornetes. Coloque el tubo de aire de modo que es de aproximadamente 10 mm de distancia del lugar de grabación. El caudal es de unos 600 ml / min.
5. Ajuste el amplificador a modo DC (amplificación AC induce artefactos en la señal EOG) con filtro de paso bajo a 1 kHz, y el aumento en 100 veces.
6. Monte de grabación y de referencia en el micromanipulador.
7. Baje el electrodo de referencia en el pozo en el plato de montaje y cubrir con una solución de tal manera que está conectado eléctricamente con el tejido modificado Ringer.
8. Baje con cuidado el electrodo de registro sobre la superficie del cornete IIb o III. El electrodo debe tocar la superficie del epitelio olfativo! Cuando el electrodo está en contacto con el epitelio (es decir, se completa un circuito eléctrico) una línea de base recta aparecerá en el osciloscopio.
9. Coloque una botella de olor para el lado de babor en el tubo de suministro de aire.
10. En el equipo, iniciar un protocolo de estimulación. La tasa de muestreo para la adquisición de datos debe ser de 2 kHz o mayor. El software dará lugar a un pulso de olor y comenzar a grabar.
11. Un protocolo de estimulación típico puede ser un pulso de 100 mseg de duración única, a la par de 100 mseg pulsos separados por un intervalo de 1 segundo, o 10 segundos de pulso sostenido.
12. Espere un tiempo entre los protocolos de manera que el tejido es muy poco adaptadas. Un minuto es suficiente para las concentraciones de líquido de acetato de amilo y heptaldehyde hasta 10 ^-3 M, en concentraciones más altas permiten 5 minutos. Después de la entrega de altas concentraciones de olor (como al final de una curva dosis-respuesta) olor residual puede permanecer en el tubo. Lave el tubo de aire con un 95% de etanol y seco antes de continuar con las muestras de tejido.
13. Axograph software ofrece herramientas para la medición de los parámetros clave de la señal EOG. Estos parámetros incluyen la amplitud de la respuesta, la latencia, el tiempo de pico, y constantes de tiempo de terminación. Puede ser conveniente para filtrar digitalmente las huellas a 25 Hz antes de su posterior análisis.

Resultados representante

Figura 1. Los parámetros para el análisis de EOG. Varios parámetros de la EOG son particularmente útiles para la comparación de las respuestas entre los ratones, incluyendo la amplitud de respuesta, la latencia (el tiempo entre el momento en que el estímulo se administra y se inicia la respuesta), el aumento del tiempo (el tiempo entre el comienzo de la respuesta y el pico), tiempo hasta el pico (el tiempo desde el inicio de la estimulación a la cima de la respuesta), y la constante de tiempo de terminación (τ, determinado mediante el ajuste de la fase de caída de la respuesta a una ecuación exponencial simple ). Para la comparación de los parámetros cinéticos como la latencia, el tiempo de subida, y la constante de tiempo de terminación, es aconsejable para normalizar la amplitud máxima de las respuestas antes del análisis.

Figura 2. Representante de las señales de EOG en protocolos de estimulación diferente. (A) Ejemplos de EOGs de un ratón en respuesta a la estimulación con concentraciones crecientes de acetato de amilo. La línea de negro en la parte superior del panel indica el tiempo y la duración de la estimulación olor. Las concentraciones en la leyenda son las concentraciones de la solución líquida. (B) una relación dosis-respuesta promedio de cinco ratones. Las barras de error son del 95% intervalos de confianza. La disminución de la amplitud de pico se observa a menudo en concentraciones olor muy alto. (C) Un ejemplo de EOG en respuesta a una estimulación pareada de pulso. Un solo pulso corto de olor provoca la adaptación que dura varios segundos. (D) Un ejemplo de EOG en respuesta a una de 10 segundos de estimulación sostenida de olor. El EOG muestra desensibilización durante la presentación de olor continuo.

Discusión

Con la configuración descrita en este protocolo, los estímulos de olor en la superficie del epitelio olfativo serán compatibles entre preparaciones de tejidos, que permite la comparación entre el tipo salvaje y ratones mutantes, a pesar de que la concentración de olor y la dinámica exacta se desconoce. Varios factores, especialmente la ubicación de la grabación y la velocidad de flujo de aire húmedo, causan variaciones en la EOG. Se debe tener cuidado para grabar desde posiciones similares en el mismo para minimizar la variación de los cornetes. Esto se puede conseguir fácilmente de forma constante la grabación desde el mismo lado de la cabeza y mantener la huella del microscopio, tubo de olor, y micromanipuladores en la mesa de aire sin cambios entre las muestras de tejido. Además, muestras de tejidos deben ser puestos inmediatamente en el flujo de aire húmedo después de la disección para evitar la desecación excesiva de los tejidos.

Grabaciones de EOG en ratones también pueden llevarse a cabo con un aparato de perfusión de líquido al pasar el ratón preparado cornetes ^{7, 14, 15,} o dejando la cabeza intacta e insertar el electrodo en un pequeño agujero por encima de los ^{16 cornetes, 17.} Cada variación de grabación EOG tiene sus propias fortalezas: la fase de aire grabaciones en preparaciones de tejidos como se describe en este protocolo requiere una cantidad mínima de instalación y son los más fáciles de llevar a cabo, las grabaciones con un aparato de perfusión líquido facilitar el uso de reactivos farmacológicos, aunque la naturaleza hidrofóbica de sustancias odoríferas muchos complica la entrega de olor, por último, las grabaciones en las que se deja intacta la cabeza se pueden utilizar en "artificial olfatear" los experimentos, a pesar de la colocación del electrodo es más difícil que cuando los cornetes están totalmente expuestos.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air delivery tube	equipment	Custom Made		The barrel of a 1-mL syringe with a T-fitting can be used as a substitute
Air table	equipment	Newport Corp.	LW3030B-OPT
Amplifier	equipment	Warner Instruments	DP-301
Computer and Data Acquisition Software	equipment	Axograph 4.9.2 on Apple Macintosh		Updated versions of Axograph for Mac OS X and Windows are available from http://axographx.com/.
Butane torch	equipment			A crème brûlèe torch works well
Digitizer	equipment	Axon Instruments	Digidata 1322A
Dissecting Scope	equipment	Scienscope	SSZ
Electrode holder	equipment	Harvard Apparatus	64-1021
Magnetic Holding Devices (12 mm)	equipment	World Precision Instruments, Inc.	M10
Micromanipulators	equipment	World Precision Instruments, Inc.	M3301R M3301L
Micropipette Puller	equipment	Sutter Instrument Co.	P2000
Oscilloscope	equipment	Tektronix, Inc.	5110
Picospritzer III	equipment	Parker Hannifin Corporation
Silicone tubing	equipment	Nalge Nunc international
Specimen stage	equipment	Custom Made		Any small solid object can be used to elevate the mounting dish. Immobilize the dish with modeling clay.
18 gage needles	material	BD Biosciences	305195
2 oz. glass bottles	material	VWR international	16152-201
Glass capillaries	material	World Precision Instruments, Inc.	TW150F-6
Silicone stoppers size 16D	material	Chemware	D1069809
Silver wire	material	World Precision Instruments, Inc.	AGW1010
SylGuard 184	material	Dow Corning	SYLG184	From World Precision Instruments
Agarose	reagent	Invitrogen	15510-027
Amyl acetate	reagent	Aldrich	W504009
Calcium chloride (CaCl2)	reagent	Sigma-Aldrich	C-1016
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	reagent	Sigma-Aldrich	D5879
HEPES	reagent	Fisher Scientific	BP310
Heptaldehyde	reagent	Aldrich	H2120
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2+6H2O)	reagent	Sigma-Aldrich	M9272
Sodium chloride (NaCl)	reagent	JT Baker	3624-05
flowmeter	equipment	Gilmont Instruments	GF-2260