Анализ Ответы Мышь обонятельной сенсорных нейронов Использование воздушного фазы Electroolfactogram Запись

Резюме

Electroolfactogram (EOG) запись информативный, простой в поведении, и надежный способ оценки обонятельной функции на уровне обонятельного эпителия. Этот протокол описывает настройки записи, подготовка ткани мыши, сбор данных, и основной анализ данных.

Аннотация

Животные зависит от обоняния для многих критических поведения, такие как поиск источников пищи, избегая хищников, а также выявление conspecifics для спаривания и других социальных взаимодействий. Electroolfactogram (EOG) запись информативными, легко провести, и надежный метод анализа обонятельной функции на уровне обонятельного эпителия. С 1956 описание ЭОГ по Оттосон в лягушек ^1, EOG записи уже применяются во многих позвоночных, в том числе саламандры, кроликов, крыс, мышей и человека (рассматривается Скотт и Scott-Джонсона, 2002 г., исх. 2). Последних достижений в области генетических модификаций у мышей, возродили интерес к записи ЭОГ для физиологических характеристик обонятельной функции в нокаут и стук-у мышей. EOG записи были успешно применены для демонстрации центральную роль обонятельных передачи сигнала компонентов ^3-8, а в последнее время для характеристики вклада определенных регулирующих механизмов для OSN ответы ^9-12.

Одоранта обнаружения происходит на поверхности обонятельного эпителия на реснички OSNs, где каскад передачи сигнала приводит к открытию ионных каналов, создавая ток, который течет в ресничек и деполяризации мембраны ^13. EOG является отрицательный потенциал записан внеклеточно на поверхности обонятельного эпителия при одоранта стимуляции, в результате суммирования потенциальные изменения, вызванные отдельными реагировать OSNs в поле записи ^2. Сравнение амплитуды и кинетики EOG таким образом получить ценную информацию о том, как генетическая модификация и другие экспериментальные манипуляции влияние молекулярной сигнализации, лежащие в основе ОСН ответ на запах.

Здесь мы опишем воздушной фазы EOG записи на подготовку мыши обонятельных раковин. Короче говоря, после того ущерба для мыши, обонятельных раковин которые предоставляются рассекает голову по средней линии и удаления перегородки. Подготовка раковин помещается в настройки записи, и запись электрод помещается на поверхности обонятельного эпителия на одном из медиальной раковин. Электрод электрически соединен с ткани через буферный раствор. Непрерывный поток увлажненный воздух подается на поверхность эпителия держать его влажным. Паров одоранта решений пыхтел в поток увлажненного воздуха, чтобы стимулировать эпителия. Ответы записываются и оцифрованы для дальнейшего анализа.

протокол

Часть 1. EOG настройки записи

Регистрирующей аппаратуры состоит из записи электрод, электрод сравнения, трубки подачи воздуха, образец этапе и рассекает микроскоп, все зиждется на воздухе таблице в клетку Фарадея. Микроманипуляторы используются для размещения электродов и трубки подачи воздуха. Непрерывный поток воздуха пропускают через дистиллированную воду, чтобы добавить влажности до прохождения через трубку подачи воздуха и более образцов. 60 мм культуры блюдо заполнено Sylgard на глубину 6-8 мм используется в качестве монтажной поверхности для образца. Ну и канал выдолбленные из Sylgard в монтажной блюдо, чтобы обеспечить средства для электрического соединения электрода к образцу через решение изменение Рингера.

Электрод записи и электрода сравнения подключены к усилителю. Сигналы от усилителя направляются дигитайзер, а затем компьютер. Программное обеспечение таких как Axograph или pClamp могут быть использованы для контроля стимуляции протокола, для записи сигнала, так и для последующего анализа ответов. Осциллограф подключен после усилитель может быть удобно для мониторинга в реальном времени электрического потенциала при размещении записи электрода и в течение EOG записей.

Доставка одоранта стимулы контролируется Picospritzer, который подключен к той же компьютер используется для получения сигнала. Давление воздуха на Picospritzer составляет 10 фунтов на квадратный дюйм. На одном баке воздуха и регулятор может быть использован для подачи воздуха для обеих таблиц воздуха и Picospritzer. Второй танк воздуха и регулятор используется для подачи воздуха для увлажненных воздушного потока, так как это требует более низкого давления и большой объем воздуха. Незадолго до доставки одоранта стимул, выход Picospritzer подключен к одоранта бутылку. Одоранта бутылку затем подключается к трубе подачи воздуха.

Часть 2: Подготовка электродов

Запись электрод chlorided серебряной проволоки в вытащил стеклянный капилляр заполненный раствором изменение Рингера (135 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ CaCl _2, 1,5 мМ MgCl _2, 10 мМ HEPES, рН 7,4, фильтруют стерилизованные). Электрода сравнения chlorided серебряной проволоки.

1. Установить серебряной проволоки в держатель электрода. Для записи электрода, один для двух сантиметров провода должны выступать с конца держателя электрода. Более провод можно оставить для электрода сравнения.
2. Чтобы добавить AgCl пальто серебряной проволокой, положение проволоки в 0,1 М NaCl и подключить держатель электрода к положительному выводу 1.5-9 V источник питания постоянного тока. Отрицательный вывод источника питания должен быть электрически соединен с 0,1 М раствора NaCl. Разрешить chloriding протекания реакции в течение 10 минут. Для выравнивания статического заряда между записью и электрода сравнения, кратко коснуться электродов вместе перед их установкой на регистрирующей аппаратуры.
3. Вытяните стеклянный капилляр использованием съемника микропипетки. Открытие на кончике капилляра должна быть около 5-10 мкм в диаметре.
4. Используйте алмазный карандаш, чтобы оценка и разорвать тупым концом капилляра, так что ~ 2 см длиннее серебряной проволоки. Пожар-польский срез с бутан факел.
5. Растопите 0,5% агарозы в растворе изменение Рингера. Вытяните небольшое количество раствора в расплаве агарозы в кончик электрода использованием передачи пипетки.
6. Заполните вытащил капиллярной около 1 / 2 пути с решением изменение Рингера (шприц, которая была разогрета и вытащил иметь длинный тонкий конец полезно для этой цели). Аккуратно вылить содержимое капиллярных выбить любые воздушные пузыри. Магазин заполнен электрода в хранилище банка с небольшим количеством раствора Рингера изменение в нижнем пока они не готовы к использованию. Как только образец ткани подготовлены и готовы к записи, установить заполнить капиллярные за проволочным электродом записи.

Часть 3: Подготовка решений одоранта

Ацетат отдушки амиловый и heptaldehyde вызывают большие ответы и, таким образом, хороший выбор как EOG стимуляторов.

1. В микроцентрифужных труб, подготовить серию разведений одоранта в диметилсульфоксид (ДМСО). В качестве отправной точки для кривой доза-реакция, готовят 10-кратные разведения от 5 м до 5 х 10 ^-6 М. Сделайте свежие разведения каждый день.
2. Дальнейшее разбавление отдушки 50-кратного в воду путем смешивания 100 мкл разбавленного акции в ДМСО с 4,9 мл воды в 2 бутылки унцию с силиконовыми пробками. Пусть решения равновесие в бутылках не менее 30 минут. Обратите внимание, что концентрация паров одорантов в каждой бутылке, неизвестно, но будет варьироваться в зависимости от концентрации пахучих веществ в жидкой фазе.
3. Вставьте две 18-иглы через кремний пробкой рrovide входных и выходных портов. Порты должны быть подключены, если бутылка не используется.

Часть 4: Запись EOG и анализа данных

1. Жертва мыши СО ₂ эвтаназии или передозировка анестетика следует обезглавливание. Удаление кожного покрова черепа и sagittally пополам голову по средней линии.
2. Горы половину головы, медиальной стороной вверх, на монтажной блюдо. Осторожно удалите перегородки подвергать раковин.
3. Место блюдо с установленными ткани на стадии записи. Совместите этапе, с тем, что записи на месте раковин по центру под микроскопом.
4. Включите баллон с воздухом для доставки увлажненного воздуха на поверхность раковин. Установите трубку подачи воздуха так, чтобы она составляет примерно 10 мм от записи местоположения. Расход ~ 600 мл / мин.
5. Установите усилитель в постоянный режим (AC усиление будет вызывать артефакты в EOG сигнала) с ФНЧ на частоте 1 кГц, и получить на 100X.
6. Горы записи и электродов на микроманипуляторами.
7. Нижний электрод в скважину на монтаж блюдо и накрыть решение изменение Рингера такова, что она имеет электрическое соединение с тканью.
8. Осторожно опустите записи электродов на поверхность раковин IIb или III. Электрод должен едва касаться поверхности обонятельного эпителия! Когда электрод приходит в соприкосновение с эпителием (то есть завершает электрической цепи) прямая исходная линия появится в осциллограф.
9. Прикрепить одоранта бутылку в сторону порта на трубе подачи воздуха.
10. На компьютере, инициировать возбуждение протокола. Частота дискретизации для получения данных должна быть 2 кГц и выше. Программное обеспечение будет вызвать запах пульс и начать запись.
11. Типичный протокол стимуляции может быть на 100 мсек одного импульса, в паре 100-мс импульсов, разделенных 1-сек интервал, или 10 сек устойчивый импульс.
12. Разрешить какое-то время между протоколами так ткани минимально адаптировать. Одна минута достаточно для жидких концентрации амилацетат и heptaldehyde до 10 ^-3 М; при более высоких концентрациях позволяют за 5 минут. После доставки высокие концентрации запаха (например, в конце кривой доза-реакция), остаточный запах может остаться в трубе. Вымойте воздушной трубки с 95% этанола и сухой, прежде чем продолжить дополнительные образцы ткани.
13. Axograph программное обеспечение предоставляет инструменты для измерения основных параметров EOG сигнала. Такие параметры включают в себя АЧХ, задержка, время до пика, и постоянные времени прекращения. Может быть желательно для цифровой фильтр следов при 25 Гц до дальнейшего анализа.

Представитель Результаты

Рисунок 1. Параметры для EOG анализа. Несколько параметров EOG особенно полезны для сравнения ответов между мышами, в том числе ответ амплитуды, латентности (времени между моментом, когда стимул находится в ведении и реакция начинается), время нарастания (время между началом ответных мер и пик), время до пика (время от начала стимуляции до пика ответа), а постоянная времени прекращения (τ, ​​определяется путем подбора фазе спада ответ на одно показательное уравнение ). Для сравнения кинетических параметров, таких как задержки, время нарастания, и постоянная времени окончания, рекомендуется для нормализации амплитудой ответы до анализа.

Рисунок 2. Представитель EOG сигналы по различным протоколам стимуляции. () Примеры EOGs от мыши в ответ на стимуляцию с увеличением концентрации амилацетат. Черная линия в верхней части панели указывает сроки и продолжительность одоранта стимуляции. Концентрации в легенды концентрации жидкого раствора. (Б) доза-реакция в среднем от пяти мышей. Планки погрешностей на 95% доверительными интервалами. Снижение максимальной амплитудой часто наблюдается при очень высоких концентрациях запах. (С) пример EOG в ответ на парных импульсов стимуляции. Одного короткого импульса одоранта вызывает адаптации длится несколько секунд. (Г) пример EOG в ответ на 10-секундный устойчивого одоранта стимуляции. EOG показывает десенсибилизации при непрерывной презентации одоранта.

Обсуждение

При установке, описанной в этом протоколе одоранта стимулов на поверхности обонятельного эпителия будет соответствовать между тканевых препаратов, что позволяет для сравнения между дикого типа и мутантных мышей, хотя точная концентрация одоранта и динамика неизвестны. Ряд факторов, в частности о месте записи и скорость потока увлажненного воздуха, вызывают изменения в EOG. Следует проявлять осторожность, чтобы запись из схожие позиции по той же раковины, чтобы минимизировать вариации. Это может быть легко достигнуто последовательно записи с той же стороны головы и поддержания след микроскоп, трубки запах доставки и микроманипуляторами в эфире таблице неизменными между образцы тканей. Кроме того, образцы ткани должны быть немедленно помещены в увлажненные поток воздуха после вскрытия, чтобы предотвратить чрезмерное высыхание ткани.

EOG записи на мышах также может осуществляться с жидким аппарата перфузии на подготовленные мыши раковин ^{7, 14, 15,} или, оставив нетронутыми голову и вставки электрода в маленькое отверстие пробурено выше раковин ^{16, 17.} Каждое изменение EOG записи имеет свои сильные стороны: воздушно-фазы записи на тканевые препараты, как описано в данном протоколе, требуют минимального количества настройки и являются самыми легкими поведения; записи на основе жидкого аппарата перфузии облегчить использование фармакологических реагентов, хотя гидрофобный характер многих отдушки усложняет запах поставки; наконец, записи, в которых голова остается без изменений могут быть использованы в «искусственной нюхать" эксперименты, хотя электрода размещения является более трудным, чем когда раковин являются полностью открыты.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air delivery tube	equipment	Custom Made		The barrel of a 1-mL syringe with a T-fitting can be used as a substitute
Air table	equipment	Newport Corp.	LW3030B-OPT
Amplifier	equipment	Warner Instruments	DP-301
Computer and Data Acquisition Software	equipment	Axograph 4.9.2 on Apple Macintosh		Updated versions of Axograph for Mac OS X and Windows are available from http://axographx.com/.
Butane torch	equipment			A crème brûlèe torch works well
Digitizer	equipment	Axon Instruments	Digidata 1322A
Dissecting Scope	equipment	Scienscope	SSZ
Electrode holder	equipment	Harvard Apparatus	64-1021
Magnetic Holding Devices (12 mm)	equipment	World Precision Instruments, Inc.	M10
Micromanipulators	equipment	World Precision Instruments, Inc.	M3301R M3301L
Micropipette Puller	equipment	Sutter Instrument Co.	P2000
Oscilloscope	equipment	Tektronix, Inc.	5110
Picospritzer III	equipment	Parker Hannifin Corporation
Silicone tubing	equipment	Nalge Nunc international
Specimen stage	equipment	Custom Made		Any small solid object can be used to elevate the mounting dish. Immobilize the dish with modeling clay.
18 gage needles	material	BD Biosciences	305195
2 oz. glass bottles	material	VWR international	16152-201
Glass capillaries	material	World Precision Instruments, Inc.	TW150F-6
Silicone stoppers size 16D	material	Chemware	D1069809
Silver wire	material	World Precision Instruments, Inc.	AGW1010
SylGuard 184	material	Dow Corning	SYLG184	From World Precision Instruments
Agarose	reagent	Invitrogen	15510-027
Amyl acetate	reagent	Aldrich	W504009
Calcium chloride (CaCl2)	reagent	Sigma-Aldrich	C-1016
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	reagent	Sigma-Aldrich	D5879
HEPES	reagent	Fisher Scientific	BP310
Heptaldehyde	reagent	Aldrich	H2120
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2+6H2O)	reagent	Sigma-Aldrich	M9272
Sodium chloride (NaCl)	reagent	JT Baker	3624-05
flowmeter	equipment	Gilmont Instruments	GF-2260