Analizzando le risposte di topo neuroni olfattivi sensoriali che utilizzano l'aria in fase di registrazione Electroolfactogram

Riepilogo

L'(EOG) è una registrazione electroolfactogram informativo, facile da condurre, e affidabile di valutazione della funzione olfattiva a livello dell'epitelio olfattivo. Questo protocollo descrive una configurazione di registrazione, di preparazione dei tessuti del mouse, raccolta dati e analisi dei dati di base.

Abstract

Gli animali dipendono da olfatto per molti comportamenti critici, quali la ricerca di fonti di cibo, evitando i predatori, e di individuare i conspecifici per l'accoppiamento e altre interazioni sociali. L'(EOG) registrazione electroolfactogram è un metodo informativo, facile da condurre, e affidabile per la funzione di analisi olfattiva a livello dell'epitelio olfattivo. Dato che la descrizione 1956 del EOG da Ottoson nelle rane ^1, la registrazione EOG è stata applicata in molti vertebrati compreso salamandre, conigli, ratti, topi ed esseri umani (recensione da Scott e Scott-Johnson, 2002, rif. 2). I recenti progressi nella modificazione genetica nei topi hanno riacceso l'interesse per la registrazione EOG per la caratterizzazione fisiologica della funzione olfattiva in knock-out e knock-in topi. EOG registrazioni sono state applicate con successo per dimostrare il ruolo centrale dei componenti olfattive trasduzione del segnale ^3-8, e più recentemente per caratterizzare il contributo di alcuni meccanismi di regolazione di risposte OSN ^9-12.

Rilevazione odorizzante avviene alla superficie dell'epitelio olfattivo sulle ciglia di OSNs, dove una cascata di trasduzione del segnale porta all'apertura di canali ionici, generando una corrente che fluisce nel ciglia e depolarizza la membrana ^13. L'EOG è il potenziale negativo registrato extracellulare sulla superficie dell'epitelio olfattivo sulla stimolazione odorizzante, frutto di una sommatoria dei cambiamenti potenziali causate da singoli OSNs reattivo nel campo di registrazione ^2. Confronto fra l'ampiezza e la cinetica del EOG quindi fornire preziose informazioni su come modificazione genetica e le altre manipolazioni sperimentali influenzare la segnalazione molecolari alla base della risposta OSN di odore.

Qui si descrive un impianto di fase di registrazione EOG su una preparazione di turbinati del mouse olfattivo. In breve, dopo aver sacrificato il mouse, i turbinati olfattivi sono esposti da bisecando la testa lungo la linea mediana e la rimozione del setto. La preparazione turbinati viene poi messo nel setup di registrazione, e un elettrodo di registrazione è posto alla superficie dell'epitelio olfattivo su uno dei turbinati mediale. Un elettrodo di riferimento è collegato elettricamente al tessuto attraverso una soluzione tampone. Un flusso continuo di aria umidificata è soffiato sulla superficie dell'epitelio per mantenerlo umido. Il vapore di soluzioni odorizzante si gonfia nel flusso di aria umidificata per stimolare l'epitelio. Le risposte sono registrati e digitalizzati per ulteriori analisi.

Protocollo

Parte 1. Il setup di registrazione EOG

L'apparato di registrazione è costituito da un elettrodo di registrazione, elettrodo di riferimento, consegna camera d'aria, lo stadio dei campioni, e microscopio da dissezione, tutte ancorate su un tavolo d'aria all'interno di una gabbia di Faraday. Micromanipolatori sono utilizzati per il posizionamento degli elettrodi e il tubo di mandata aria. Un flusso continuo dell'aria è gorgogliare attraverso acqua distillata da aggiungere prima che l'umidità che passa attraverso il tubo di mandata aria e il campione. Un piatto della cultura 60 millimetri riempito con Sylgard ad una profondità di 6-8 mm è utilizzato come superficie di montaggio per il campione. Un pozzo e un canale sono scavate nella Sylgard nel piatto di montaggio per fornire un mezzo per collegare elettricamente l'elettrodo di riferimento al modello tramite soluzione modificata Ringer.

L'elettrodo di registrazione e l'elettrodo di riferimento sono collegati ad un amplificatore. Segnali dal amplificatore vengono inviati a un digitalizzatore e poi a un computer. Software come Axograph o pClamp può essere usato per controllare il protocollo di stimolazione, per registrare il segnale, e per la successiva analisi delle risposte. Un oscilloscopio collegato dopo l'amplificatore può essere conveniente per il monitoraggio in tempo reale del potenziale elettrico, mentre ponendo l'elettrodo di registrazione e durante le registrazioni EOG.

Consegna degli stimoli olfattivi è controllato da un Picospritzer, che è collegato allo stesso computer utilizzato per l'acquisizione del segnale. La pressione dell'aria in Picospritzer è impostato a 10 psi. Un serbatoio di aria singola e regolatore può essere utilizzato per fornire aria sia al tavolo aria e la Picospritzer. Un serbatoio di aria secondo e il regolatore viene utilizzato per fornire aria per il flusso di aria umidificata, in quanto ciò richiede una pressione più bassa e una grande quantità di flusso d'aria. Appena prima di fornire uno stimolo olfattivo, l'uscita Picospritzer è collegato a una bottiglia di odorizzante. La bottiglia odorizzante viene poi collegato al tubo di mandata aria.

Parte 2: Preparazione di elettrodi

L'elettrodo di registrazione è un filo d'argento chlorided in un bicchiere tirato capillare riempito con soluzione modificato Ringer (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl _2, 1,5 mM MgCl _2, 10 HEPES mM, pH 7,4, filtro sterilizzato). L'elettrodo di riferimento è un filo d'argento chlorided.

1. Installare il filo d'argento nel supporto elettrodo. Per l'elettrodo di registrazione, 1-2 centimetri di filo deve sporgere dalla fine del porta elettrodo. Più filo può essere lasciato per l'elettrodo di riferimento.
2. Per aggiungere il cappotto AgCl al filo d'argento, la posizione del filo di 0,1 M di NaCl e collegare la porta elettrodo al polo positivo di una potenza 1,5-9 fonte V DC. Il terminale negativo della fonte di alimentazione deve essere collegato elettricamente alla soluzione 0,1 M di NaCl. Lasciare che la reazione chloriding procedere per 10 minuti. Per pareggiare qualsiasi carica elettrostatica tra la registrazione e l'elettrodo di riferimento, brevemente toccare gli elettrodi insieme prima di installarli sul apparecchi di registrazione.
3. Tirare un capillare di vetro con un estrattore micropipetta. L'apertura alla punta del capillare dovrebbe essere di circa 5-10 micron di diametro.
4. Usare una matita diamante per segnare e rompere la punta smussata del capillare per cui è ~ 2 cm più lungo il filo d'argento. Fire-lucidare l'estremità tagliata con la torcia butano.
5. Fate sciogliere lo 0,5% di agarosio in soluzione modificata Ringer. Tirare una piccola quantità di soluzione di agarosio fuso nella punta dell'elettrodo con una pipetta di trasferimento.
6. Riempire il capillare tirato circa 1 / 2 del modo con la soluzione modificato Ringer (una siringa che è stato riscaldato e tirato per avere un finale lungo e sottile è utile per questo scopo). Picchiettare lievemente la capillare per rimuovere eventuali bolle d'aria. Conservare l'elettrodo riempito il vaso di storage con una piccola quantità di soluzione di Ringer modificato in fondo finché non sono pronti per essere utilizzati. Una volta che un campione di tessuto è preparato e pronto per la registrazione, installare un capillare riempito oltre il filo elettrodo di registrazione.

Parte 3: Preparazione di soluzioni di odorizzante

L'acetato di amile odoranti e heptaldehyde evocano le risposte di grandi dimensioni e sono scelte così buona come stimolanti EOG.

1. In tubi microcentrifuga, preparare una serie di diluizioni di odorizzante in dimetilsolfossido (DMSO). Come punto di partenza per una curva dose-risposta, preparare diluizioni 10-M da 5 a 5 x 10 ^-6 M. Diluire fresco ogni giorno.
2. Diluire ulteriormente il odoranti di 50 volte in acqua mescolando il 100 microlitri magazzino diluito in DMSO con 4,9 ml di acqua 2 bottiglie con tappi di silicone oncia. Lasciate che le soluzioni equilibrare in bottiglia per almeno 30 minuti. Si noti che la concentrazione di vapore di odoranti in ogni bottiglia è sconosciuta, ma può variare in funzione della concentrazione di odoranti in fase liquida.
3. Inserire due 18-gauge aghi attraverso il tappo di silicone per provide porte di input e di output. Le porte deve essere collegato quando la bottiglia non è in uso.

Parte 4: la registrazione dei dati e l'analisi EOG

1. Sacrificio di un mouse da CO ₂ l'eutanasia o seguito da overdose di anestetico decapitazione. Rimuovere la cute sovrastante il cranio e sagittalmente dividono in due la testa lungo la linea mediana.
2. Montare una metà della testa, lato mediale alto, sul piatto di montaggio. Rimuovere con attenzione il setto per esporre i turbinati.
3. Porre la capsula con il tessuto montato sul palco di registrazione. Allineare il palco in modo che la posizione di registrazione sul turbinati è centrata sotto il microscopio.
4. Accendere il serbatoio d'aria per fornire aria umidificata alla superficie turbinati. Posizionare il tubo di mandata aria in modo che si tratta di circa 10 mm di distanza dal luogo della registrazione. La portata è ~ 600 ml / min.
5. Impostare l'amplificatore in modalità DC (amplificazione AC indurrà artefatti nel segnale EOG) con filtro passa-basso a 1 kHz, e guadagno a 100X.
6. Monte di registrazione ed elettrodi di riferimento sul micromanipolatori.
7. Abbassare l'elettrodo di riferimento nel pozzo sul piatto di montaggio e coprire con la soluzione in modo che sia collegato elettricamente il tessuto modificato Ringer.
8. Abbassare con cautela l'elettrodo di registrazione sulla superficie del turbinati IIb o III. L'elettrodo dovrebbe toccare appena la superficie dell'epitelio olfattivo! Quando l'elettrodo viene in contatto con l'epitelio (cioè completa di un circuito elettrico), una linea di base diritta apparirà l'oscilloscopio.
9. Fissare una bottiglia odorizzante alla porta laterale sul tubo di mandata aria.
10. Sul computer, avviare un protocollo di stimolazione. La frequenza di campionamento per l'acquisizione dei dati dovrebbero essere 2 kHz o superiore. Il software attiverà un impulso odore e iniziare la registrazione.
11. Un tipico protocollo di stimolazione può essere un 100 msec durata dell'impulso singolo, coppia di 100 msec impulsi separati da un intervallo di 1 secondo, oppure a 10 secondi impulso sostenuta.
12. Prendetevi del tempo tra i protocolli in modo che il tessuto è minimamente adatta. Un minuto è sufficiente per concentrazioni di liquido di acetato di amile e heptaldehyde fino a 10 m ^-3; a concentrazioni più elevate a 5 minuti. Dopo la consegna alte concentrazioni di odori (come alla fine di una curva dose-risposta) odore residua può rimanere nel tubo. Lavare il tubo dell'aria con il 95% di etanolo e asciugare prima di continuare con campioni di tessuto aggiuntivo.
13. Axograph software offre strumenti per misurare i parametri chiave del segnale EOG. Tali parametri sono l'ampiezza di risposta, la latenza, il tempo di picco, e le costanti di tempo di terminazione. Può essere auspicabile per filtrare digitalmente tracce a 25 Hz prima di ulteriori analisi.

Rappresentante Risultati

Figura 1. Parametri per l'analisi EOG. Diversi parametri di dell'EOG sono particolarmente utili per il confronto delle risposte tra topi, tra cui l'ampiezza di risposta, la latenza (il tempo tra quando lo stimolo viene somministrato e la risposta inizia), tempo di salita (il tempo tra l'inizio della risposta e la vetta), il tempo di picco (il tempo tra l'inizio della stimolazione al picco della risposta), e la costante di tempo di terminazione (τ, determinato dal montaggio della fase di decadimento della risposta a una singola equazione esponenziale ). Per il confronto dei parametri cinetici come la latenza, tempo di salita, e la costante di tempo di risoluzione, si consiglia di normalizzare l'ampiezza di picco delle risposte prima dell'analisi.

Figura 2. Rappresentante EOG segnali in diversi protocolli di stimolazione. (A) Esempi di EOGs da un topo in risposta alla stimolazione con concentrazioni crescenti di acetato di amile. La linea nera nella parte superiore del pannello indica i tempi e la durata della stimolazione odorizzante. Le concentrazioni nella leggenda sono le concentrazioni della soluzione liquida. (B) una relazione dose-risposta in media da cinque topi. Le barre di errore sono gli intervalli di confidenza al 95%. Un calo del picco di ampiezza è spesso osservata a concentrazioni odore molto elevate. (C) Un esempio di EOG in risposta ad una coppia impulsi di stimolazione. Un singolo impulso breve di odorizzante suscita adattamento della durata di alcuni secondi. (D) Un esempio di EOG in risposta ad un 10-secondi sostenuta stimolazione odorizzante. L'EOG mostra desensibilizzazione durante la presentazione odorizzante continuo.

Discussione

Con la configurazione descritta in questo protocollo, gli stimoli olfattivi sulla superficie dell'epitelio olfattivo sarà coerente tra i preparati di tessuto, permettendo il confronto tra topi wild-type e mutanti, anche se la concentrazione di odorizzante esatta e le dinamiche sono sconosciute. Diversi fattori, in particolare la posizione di registrazione e la portata di aria umidificata, causare variazioni nel EOG. Si deve prestare attenzione a registrare da posizioni simili sulla stessa turbinato per minimizzare variazione. Questo può essere facilmente ottenuto la registrazione costantemente dallo stesso lato della testa e mantenendo l'impronta del microscopio, la consegna tubo odore, e micromanipolatori sul tavolo aria invariato tra campioni di tessuto. Inoltre, campioni di tessuto devono essere immediatamente inseriti nel flusso di aria umidificata, dopo la dissezione, per evitare l'essiccamento eccessivo del tessuto.

Registrazioni EOG sui topi possono anche essere effettuata con un apparato di perfusione liquido al passaggio del mouse preparato turbinati ^{7, 14, 15,} oppure lasciando la testa intatta e inserendo l'elettrodo in un piccolo foro perforato al di sopra della turbinati ^{16, 17.} Ogni variazione di registrazione EOG ha i suoi pregi: aria fase registrazioni sulla preparazione dei tessuti, come descritto in questo protocollo richiede una quantità minima di impostazione e sono più facili da condurre, registrazioni con un apparato di liquido di perfusione facilitare l'uso di reagenti farmacologico, anche se il natura idrofobica di odoranti molti complica consegna odore, infine, le registrazioni in cui viene lasciato intatto il capo può essere utilizzato in 'artificiale annusare' esperimenti, anche se il posizionamento dell'elettrodo è più difficile rispetto a quando turbinati sono completamente esposti.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air delivery tube	equipment	Custom Made		The barrel of a 1-mL syringe with a T-fitting can be used as a substitute
Air table	equipment	Newport Corp.	LW3030B-OPT
Amplifier	equipment	Warner Instruments	DP-301
Computer and Data Acquisition Software	equipment	Axograph 4.9.2 on Apple Macintosh		Updated versions of Axograph for Mac OS X and Windows are available from http://axographx.com/.
Butane torch	equipment			A crème brûlèe torch works well
Digitizer	equipment	Axon Instruments	Digidata 1322A
Dissecting Scope	equipment	Scienscope	SSZ
Electrode holder	equipment	Harvard Apparatus	64-1021
Magnetic Holding Devices (12 mm)	equipment	World Precision Instruments, Inc.	M10
Micromanipulators	equipment	World Precision Instruments, Inc.	M3301R M3301L
Micropipette Puller	equipment	Sutter Instrument Co.	P2000
Oscilloscope	equipment	Tektronix, Inc.	5110
Picospritzer III	equipment	Parker Hannifin Corporation
Silicone tubing	equipment	Nalge Nunc international
Specimen stage	equipment	Custom Made		Any small solid object can be used to elevate the mounting dish. Immobilize the dish with modeling clay.
18 gage needles	material	BD Biosciences	305195
2 oz. glass bottles	material	VWR international	16152-201
Glass capillaries	material	World Precision Instruments, Inc.	TW150F-6
Silicone stoppers size 16D	material	Chemware	D1069809
Silver wire	material	World Precision Instruments, Inc.	AGW1010
SylGuard 184	material	Dow Corning	SYLG184	From World Precision Instruments
Agarose	reagent	Invitrogen	15510-027
Amyl acetate	reagent	Aldrich	W504009
Calcium chloride (CaCl2)	reagent	Sigma-Aldrich	C-1016
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	reagent	Sigma-Aldrich	D5879
HEPES	reagent	Fisher Scientific	BP310
Heptaldehyde	reagent	Aldrich	H2120
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2+6H2O)	reagent	Sigma-Aldrich	M9272
Sodium chloride (NaCl)	reagent	JT Baker	3624-05
flowmeter	equipment	Gilmont Instruments	GF-2260