空気相Electroolfactogram記録を用いたマウス嗅覚神経細胞の分析応答

要約

electroolfactogram（EOG）記録は、嗅上皮のレベルでの嗅覚機能を評価するための有益な、簡単に行動し、信頼性の高い方法です。このプロトコルは、録音の設定、マウスの組織の準備、データ収集、および基本的なデータ解析を説明します。

要約

動物はそのような、食料源を見つけるの捕食者を回避し、交配やその他の社会的相互作用のための同種を識別するなど、多くの重要な行動のための嗅覚に依存しています。 electroolfactogram（EOG）記録は、嗅上皮のレベルでのアッセイ嗅覚機能への、有益な実施が容易、かつ信頼性の高い方法です。カエル¹のOttosonによるEOG 1956年の記述以来、EOG記録はサンショウウオ、ウサギ、ラット、マウス、およびヒト（スコットとスコットジョンソン、2002、refによってレビューさ2）を含む多くの脊椎動物に適用されています。マウスの遺伝子改変の最近の進歩は、ノックアウトとマウス、ノックの嗅覚機能の生理学的特性評価のためのEOGを記録に関心を再燃している。 EOG録音が正常嗅覚シグナル伝達コンポーネント^3-8の中心的役割を示すために、そしてより最近では^9月12日 OSNの応答に特定の調節機構の寄与を特徴づけるために適用されている。

匂いの検出は、繊毛に流入し、膜^13の脱分極電流を発生、シグナル伝達カスケードは、イオンチャネルの開口につながるOSNs、の繊毛で嗅上皮の表面で発生します。 EOGは、記録のフィールド²内の個々の応答OSNsによって引き起こされる潜在的な変化の和から、その結果、匂い刺激により嗅上皮の表面で細胞外に記録された負電位である。 EOGの振幅と速度の比較は、このように遺伝子改変および他の実験操作は、臭気にOSN応答の根底にある分子のシグナル伝達をどのように影響するかについての貴重な情報を提供しています。

ここでは、マウス嗅覚甲介の準備の空気相のEOGの録音について説明します。簡単に言えば、マウスを犠牲にした後、嗅覚甲介が正中線に沿って頭を二等分し、中隔を除去することによって公開されています。鼻甲介の準備をして、録音の設定で配置され、及び記録電極は内側甲介のいずれかで嗅上皮の表面に配置されます。参照電極は、電気的に緩衝溶液を介して組織に接続されています。加湿空気の連続的な流れは、それが湿った保つために上皮の表面に吹き付けられる。匂いのソリューションの蒸気は、上皮を刺激する加湿空気​​の流れに吹きましたれる。応答が記録され、さらなる分析のためにデジタル化されています。

プロトコル

パート1。 EOGレコーディングのセットアップ

記録装置は、記録電極、参照電極、空気供給管、試料ステージ、および解剖顕微鏡、すべてのファラデーケージ内の空気のテーブルの上にアンカーで構成されています。マイクロマニピュレーターは電極の配置と空気の配信チューブに使用されます。連続的な空気の流れは、空気供給管を通って試料上に渡す前に、湿度を追加するには、蒸留水バブリングされています。 6〜8ミリメートルの深さにSylgardで満たされた60mmの培養皿は、試験片の取付け面として使用されます。よくとチャネルは電気的に変更されたリンゲル液を経由して試料に参照電極を接続するための手段を提供するために取り付け皿にSylgardがくり抜かれている。

記録電極と参照電極は、アンプに接続されています。アンプからの信号がデジタイザにし、コンピュータに送信されます。このようなAxographやpClampなどのソフトウェアは、信号を記録し、そして反応のその後の分析のために、刺激のプロトコルを制御するために使用することができます。 EOG記録時の​​記録電極を配置しながら、アンプの後に接続してオシロスコープには、電位のリアルタイム監視に便利です。

嗅覚刺激の配信は、信号収集に使用したのと同じコンピュータに接続されているPicospritzer、によって制御されます。 Picospritzerでの空気の圧力は10 psiに設定されています。単一の空気タンクとレギュレータは、エアテーブルとPicospritzer両方に空気を供給するために使用することができます。第2空気タンクとレギュレータは、これはより低い圧力と空気の流れを大量に必要とするよう、加湿空気の流れのために空気を提供するために使用されます。匂い刺激を提供する直前に、Picospritzerの出力は、匂いのボトルに接続されています。匂いのボトルは、空気供給管に接続されています。

第2部：準備電極

記録電極は、プルアップガラス修正リンゲル溶液（135 mMのNaCl、5mMのKClを、1mMのCaCl _2、1.5mMのMgCl _2、10mMのHEPES、pH7.4の、フィルター滅菌）で満たされたキャピラリー内chlorided銀線です。参照電極はchlorided銀線です。

1. 電極ホルダーに銀線を取り付けます。記録電極の場合は、ワイヤ1〜2センチ電極ホルダーの端から突出してください。より線は、参照電極のために残すことができます。
2. 銀線に塩化銀のコートを追加するには、0.1 M NaCl中でワイヤを配置し、1.5から9 V DC電源の正端子に電極ホルダーを接続してください。電源の負端子は電気的に0.1 M NaCl溶液に接続する必要があります。 10分間進行さchloriding反応を可能にする。記録と参照電極との間の静電気を均等化するために、一時的に記録装置にインストールする前に一緒に電極に触れない。
3. マイクロピペットプラーを使用してガラスキャピラリーを引き出します。キャピラリーの先端の開口部は直径5〜10ミクロン前後となるはずです。
4. それは銀線より〜2センチメートル長くなるようにキャピラリーの平滑末端を獲得し、オフブレークするダイヤモンドの鉛筆を使用してください。ブタンのトーチと切断端を火磨く。
5. 修正リンゲル溶液に0.5％アガロースを溶かす。トランスファーピペットを用いて電極の先端部に溶融アガロース溶液の少量を引き出します。
6. 修正されたリンゲル液（この目的のために有用である加熱と長い細い端を持つように引っ張られているシリンジ）との双方向の約1 / 2プルキャピラリを埋める。ゆっくりと気泡を取り除くために、キャピラリーをフリック。彼らが使用できるようになるまで底で修正されたリンゲル液を少量保存瓶に充填された電極を保管してください。組織サンプルは、準備と録音の準備が完了したら、記録電極線上に塗りつぶされたキャピラリをインストールしてください。

パート3：準備嗅覚ソリューション

着臭剤アミルアセテートとheptaldehydeが大きな応答を呼び起こすため、EOG興奮剤として適しています。

1. マイクロ遠心チューブに、ジメチルスルホキシド（DMSO）の匂いの希釈系列を用意する。用量反応曲線の開始点として、× 10 ^{-6 M、5} Mから5〜10倍希釈液を調製毎日新鮮な希釈を行う。
2. さらにシリコンのストッパー付き2オンスボトルの4.9 MLSの水とDMSO中に100μLの希釈株を混合して水に50倍に付臭剤を希釈する。ソリューションは、少なくとも30分間ボトルで平衡化してみましょう。それぞれのボトルの匂いの蒸気濃度が不明であることに注意してください、しかし液相中の臭気物質の濃度の関数として変化します。
3. pにシリコン栓を介して2台の18ゲージの針を挿入する入力ポートと出力ポートをrovide。ボトルを使用していないときにポートは接続する必要があります。

パート4：EOGを記録し、データを分析する

1. 断頭続いてCO ₂安楽死または麻酔薬過剰投与により、マウスを生け贄に捧げる。頭蓋骨を覆う皮膚を削除し、sagittally正中線に沿って頭を二等分する。
2. 取付け皿に、頭の半分、内側をマウントします。慎重に甲を公開するために隔壁を削除します。
3. 記録ステージ上にマウントされているティッシュで皿を置きます。甲介上の記録位置を顕微鏡下で中央になるようにステージの位置を合わせます。
4. 鼻甲介の表面に加湿空気を供給する空気タンクをオンにします。位置が離れて記録位置から約10mmになるよう空気供給管を。流速は、約600 mL /分です。
5. ローパス1kHzでフィルター、および100XのゲインとDCモード（ACの増幅は、EOG信号にアーティファクトを誘発する）にアンプを設定します。
6. マイクロマニピュレータの記録と参照電極をマウントします。
7. 取り付け皿にウェルに参照電極を下げて、それが電気的に組織に接続されるように変更されたリンゲル液で覆う。
8. 鼻甲介第IIbまたはIIIの表面に記録電極を慎重に下ろします。電極は、かろうじて嗅上皮の表面に触れてください！電極は、上皮（すなわち、電気回路を完了する）直線のベースラインとの接触時にオシロスコープに表示されます。
9. 空気供給管のサイドポートへの嗅覚ボトルを取り付けます。
10. コンピュータ上で、刺激のプロトコルを開始する。データ取得のためのサンプリングレートは、2 kHz以上でなければなりません。ソフトウェアは、臭気のパルスをトリガし、録音を開始します。
11. 典型的な刺激プロトコルは100ミリ秒のパルスが1秒間隔で区切られたペアの100ミリ秒持続時間単パルス、または10秒の持続性の脈があります。
12. 組織が最小限に適応されるように、プロトコル間のいくつかの時間を許可します。 1分、最大10 ^-3 Mの酢酸アミルとheptaldehydeの液体の濃度で十分です。高濃度で5分の時間を要します。高い臭気濃度を配信したあとで（そのような用量 - 反応曲線の終了時など）残留臭気は、チューブ内に残る可能性があります。追加の組織サンプルを続行する前に、95％エタノールとドライでエアチューブを洗浄してください。
13. Axographソフトウェアは、EOG信号の主要パラメータを測定するためのツールが用意されています。このようなパラメータは、応答の振幅、遅延時間、ピークまでの時間、および終了の時定数が含まれています。それはデジタルでさらに分析する前に、25 Hzでトレースをフィルタ処理することが望ましい場合があります。

代表的な結果

図1。分析をEOGためのパラメータ。EOGのいくつかのパラメータは、マウスとの間の応答の比較のために特に有用である、応答の振幅、遅延時間（刺激を投与し、応答が開始されるまでの時間）を含めて、立ち上がり時間（開始までの時間レスポンスとピークの）、ピークまでの時間（刺激開始から応答のピークまでの時間）、および終了の時定数（τ、シングル指数方程式に応答の減衰をフィッティングによって決定）。このような待ち時間、立ち上がり時間、および終了の時定数などの動特性パラメータの比較については、それは分析前に応答のピーク振幅を正規化することをお勧めします。

図2。異なる刺激プロトコルの下で代表的なEOG信号。（）マウスからEOGsの例として酢酸アミル濃度の増加による刺激への返信です。パネルの上部にある黒い線は、嗅覚刺激のタイミングと期間を示している。伝説中の濃度は、液体溶液の濃度です。 （b）の用量 - 反応関係は、5匹の平均値。エラーバーは95％の信頼区間です。ピーク振幅の減少は、しばしば非常に高い臭気濃度で観察される。 （C）ペア - パルス刺激に対する応答のEOGの例を。臭気物質の単一の短いパルスは、数秒のための永続的な適応を誘発する。 （d）は10秒に対応してEOGの例では、嗅覚刺激を持続。 EOGは、連続的な匂いのプレゼンテーション中に脱感作を示しています。

ディスカッション

このプロトコルで説明されている設定で、嗅上皮の表面の匂い刺激は、正確な匂いの濃度とダイナミクスが未知であっても、野生型と変異型マウス間の比較を可能にする、組織の準備の間に一貫性があります。いくつかの要因が、特に録音の場所と加湿空気の流量は、EOGの変動を引き起こす。ケアは、ばらつきを最小限に抑えるために、同じ鼻甲介上に同じような位置から録音に注意する必要があります。これは、簡単に一貫して頭部の同じ側から録音すると、顕微鏡、臭気デリバリーチューブ、および組織サンプルの間に変更されていないエアテーブル上でマニピュレーターのフットプリントを保つことによって達成することができます。さらに、組織サンプルをすぐに組織の過度の乾燥を防ぐために、解剖後に加湿空気流中に配置する必要があります。

マウスでEOG記録は^{、7、14、15、}またはヘッドには手をつけずと甲^16、17を超えるドリル小さな穴に電極を挿入してを甲準備マウスで液体灌流装置を用いて実施することができます。 EOG記録の各バリエーションには、独自の強みを持っています：組織標本上で空気相の記録をこのプロトコルで説明するようにセットアップの最小限の量を必要とし、実施するのが最も簡単です。液体灌流装置を使用しての録音は、薬理学的試薬の使用を促進する、ものの多くの匂い物質の疎水性の性質は、臭気の配信を複雑にし、最後に、ヘッドはそのまま残っているこれで録音は"人工的なにおいを嗅ぐ"の実験で使用することができる、電極配置は、甲が完全に露出しているときよりも難しいですが。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air delivery tube	equipment	Custom Made		The barrel of a 1-mL syringe with a T-fitting can be used as a substitute
Air table	equipment	Newport Corp.	LW3030B-OPT
Amplifier	equipment	Warner Instruments	DP-301
Computer and Data Acquisition Software	equipment	Axograph 4.9.2 on Apple Macintosh		Updated versions of Axograph for Mac OS X and Windows are available from http://axographx.com/.
Butane torch	equipment			A crème brûlèe torch works well
Digitizer	equipment	Axon Instruments	Digidata 1322A
Dissecting Scope	equipment	Scienscope	SSZ
Electrode holder	equipment	Harvard Apparatus	64-1021
Magnetic Holding Devices (12 mm)	equipment	World Precision Instruments, Inc.	M10
Micromanipulators	equipment	World Precision Instruments, Inc.	M3301R M3301L
Micropipette Puller	equipment	Sutter Instrument Co.	P2000
Oscilloscope	equipment	Tektronix, Inc.	5110
Picospritzer III	equipment	Parker Hannifin Corporation
Silicone tubing	equipment	Nalge Nunc international
Specimen stage	equipment	Custom Made		Any small solid object can be used to elevate the mounting dish. Immobilize the dish with modeling clay.
18 gage needles	material	BD Biosciences	305195
2 oz. glass bottles	material	VWR international	16152-201
Glass capillaries	material	World Precision Instruments, Inc.	TW150F-6
Silicone stoppers size 16D	material	Chemware	D1069809
Silver wire	material	World Precision Instruments, Inc.	AGW1010
SylGuard 184	material	Dow Corning	SYLG184	From World Precision Instruments
Agarose	reagent	Invitrogen	15510-027
Amyl acetate	reagent	Aldrich	W504009
Calcium chloride (CaCl2)	reagent	Sigma-Aldrich	C-1016
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	reagent	Sigma-Aldrich	D5879
HEPES	reagent	Fisher Scientific	BP310
Heptaldehyde	reagent	Aldrich	H2120
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2+6H2O)	reagent	Sigma-Aldrich	M9272
Sodium chloride (NaCl)	reagent	JT Baker	3624-05
flowmeter	equipment	Gilmont Instruments	GF-2260