Hava-faz Electroolfactogram Kayıt Fare Koku Duyu Nöronlar analizi Yanıtları

Özet

Electroolfactogram (EOG) kayıt koku epiteli düzeyinde koku alma fonksiyonu değerlendiren bir bilgilendirme yapmak için kolay ve güvenilir bir yoldur. Bu protokol bir kayıt kurulum, fare doku hazırlanması, veri toplama ve temel veri analizi açıklar.

Özet

Hayvanlar, gıda kaynakları bulma predatör kaçınarak, çiftleşme ve diğer sosyal etkileşimler conspecifics tespit gibi birçok kritik davranışları, koku bağlıdır. Electroolfactogram (EOG) kayıt koku epiteli seviyesinde tahlil koku alma işlevi, bilgilendirici yapmak için, kolay ve güvenilir bir yöntemdir. Kurbağa ¹ Ottoson tarafından EOG açıklamasını, 1956 yılından bu yana, EOG kayıt semender, tavşan, sıçan, fare, ve insanlar (Scott ve Scott Johnson, 2002, ref. 2) dahil olmak üzere pek çok omurgalıların tatbik edilmiştir. Farelerde genetik modifikasyon son gelişmeler knock-out koku alma fonksiyonu fizyolojik karakterizasyonu EOG kayıt ilgi başlattı ve fareler-vurmak var. , Koku alma sinyal iletimi ^bileşenleri 3-8 merkezi bir rol göstermek için, ve daha yakın ^zamanda 9-12 OSN yanıtları bazı düzenleyici mekanizmaların katkısı karakterize EOG kayıtları başarıyla uygulanmıştır .

Odorant algılama kirpikler akar ve membran ¹³ depolarizes bir akım üreten bir sinyal iletimi kaskad iyon kanallarının açılması için neden OSNs, kirpikler olfaktör epitelin yüzey oluşur. EOG negatif potansiyel kayıt alan ² ayrı duyarlı OSNs kaynaklanan potansiyel değişikliklerin bir toplamı sonucu, üzerine koku epiteli yüzeyinde odorant stimülasyon ekstraselüler kaydedildi. EOG genliği ve kinetik karşılaştırılması ve böylece genetik modifikasyon ve diğer deneysel manipülasyonlar koku OSN yanıt altında yatan moleküler sinyalizasyon nasıl etkilediğini hakkında değerli bilgiler sağlar.

Burada fare koku alma konkalar bir hazırlık bir hava faz EOG kayıt açıklar. Kısaca, fare ödün sonra, koku konkalar orta hat boyunca baş bisecting ve septum çıkarmadan maruz kalmaktadır. Konka hazırlık sonra kayıt kurulum yerleştirilir ve bir kayıt elektrot medial konkalar olfaktör epitelin yüzeyine yerleştirilir. Referans elektrot, elektriksel bir tampon çözelti ile dokusuna bağlıdır. Epitel yüzeyi nemli tutmak için sürekli bir nemlendirilmiş hava akımı üzerine üflenir. Odorant çözümleri buharı epitel uyarmak için nemlendirilmiş hava akışı içine şişirilmiş. Yanıtları kaydedilir ve daha fazla analiz için sayısallaştırılmış.

Protokol

Bölüm 1. EOG kayıt kurulum

Kayıt cihazları, kayıt elektrodu, referans elektrodu, hava teslim tüp numune aşama, ve diseksiyon mikroskobu, bir Faraday kafesi içinde bir hava masaya demirlemiş oluşur. Mikromanipülatörler, Elektrotların yerleştirilmesi ve hava teslim tüp kullanılır. Sürekli bir hava akımı, hava teslimat tüp aracılığıyla ve örnek üzerinden geçirmeden önce nemi eklemek için distile su ile kabarmış. Sylgard 6-8 mm derinliğe kadar dolu bir 60 mm kültür çanak örnek için bir montaj yüzeyi olarak kullanılır. Bir kuyu ve bir kanal elektrikle modifiye Ringer solüsyonu ile numune referans elektrot bağlamak için bir araç sağlamak için montaj çanak Sylgard oyulmuştur.

Kayıt elektrot ve referans elektrot bir amplifikatöre bağlı. Amplifikatör gelen sinyaller bir bilgisayar sonra sayısallaştırıcı gönderilen ve. Axograph veya pClamp Yazılım stimülasyon protokolü kontrol etmek için sinyal kayıt ve yanıtları sonraki analiz için kullanılabilir. Amplifikatör sonra bağlı bir osiloskop kayıt elektrot yerleştirerek elektrik potansiyeli gerçek zamanlı izleme ve EOG kayıtları sırasında uygun olabilir.

Odorant uyaranlara teslimi sinyal alımı için kullanılan aynı bilgisayara bağlı bir Picospritzer tarafından kontrol edilir. Picospritzer hava basıncı 10 psi ayarlanır. Tek bir hava tankı ve regülatör hava masa ve Picospritzer her iki hava besleme için kullanılabilir. Ikinci bir hava tankı ve regülatör, bu daha düşük bir basınç ve hava akımı büyük miktarda gerektirdiği gibi, nemlendirilmiş hava akışı için hava sağlamak için kullanılır. Hemen önce bir odorant uyaran teslim Picospritzer çıkışı bir odorant şişe bağlanır. Odorant şişesi sonra hava teslim tüpüne bağlı.

Bölüm 2: elektrotlar hazırlanması

Kayıt elektrot çekti cam kapiller modifiye Ringer çözeltisi (135 mM NaCl, 5 mM KCI, 1 mM CaCl _2, 1.5 mM MgCl _2, 10 mM Hepes, pH 7.4, filtre steril) ile dolu bir chlorided gümüş tel. Referans elektrot, chlorided gümüş tel.

1. Elektrot tutucu içine gümüş tel yükleyin. Kayıt elektrodu için, 1-2 santimetre tel elektrot tutucu ucundan dışarı çıkmalıdır. Daha fazla tel referans elektrot için bırakılabilir.
2. AgCl kat gümüş tel eklemek için 0,1 M NaCl tel konumu ve elektrot tutucu bir 1,5-9 V DC güç kaynağının pozitif terminaline bağlayın. Elektriksel güç kaynağı negatif terminaline 0,1 M NaCl çözeltisi bağlı olmalıdır. 10 dakika boyunca devam chloriding reaksiyon izin verin. Kayıt ve referans elektrot arasındaki herhangi bir statik yükü eşitlemek için, kısaca kayıt cihazları bunları yüklemeden önce elektrotlar birbirine dokunacak.
3. Bir bardak, bir mikropipet çektirmenin kullanarak kapiller çekin. Kapiller ucunda açılış çapı 5-10 mikron civarında olmalıdır.
4. Kılcal künt ucu, gümüş tel ~ 2 cm daha uzun, böylece skoru ve koparak bir elmas kalem kullanın. Yangın lehçe bütan meşale ile kesme ucu.
5. Modifiye Ringer solüsyonu% 0.5 'lik agaroz eritin. Elektrodun ucu bir transfer pipet kullanarak içine küçük bir miktar erimiş agaroz çözüm çekin.
6. Şekilde modifiye Ringer solüsyonu (bu amaç için yararlı ısıtılır ve uzun ince bir sonu var çekti bir şırınga) ile yaklaşık 1 / 2 çekti kılcal doldurun. Herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için yavaşça kılcal fiske. Kullanılmak üzere hazır olana kadar dolu elektrot alt modifiye Ringer çözüm küçük bir miktar ile bir kavanozda saklayın. Bir doku örneği hazırlanmış ve kayıt için hazır sonra, kayıt elektrot teli üzerinde bir dolu kılcal yükleyin.

Bölüm 3: odorant çözümler hazırlanması

Koku amil asetat ve heptaldehyde büyük tepkiler uyandırmak ve böylece EOG uyarıcılar olarak iyi seçimler.

1. Mikrosantrifüj tüplerde, dimetil sülfoksit (DMSO) odorant dilüsyonları bir dizi hazırlamak. Bir doz-yanıt eğrisi için bir başlangıç ​​noktası olarak, 5 M 5 ila 10 kat dilüsyonlarının hazırlamak x 10 ^-6 M. Solüsyondan her gün yapın.
2. Ayrıca silikon tıpa ile 2 gram şişelerde 4.9 mL su ile DMSO 100 mcL seyreltilmiş hisse karıştırılarak suda 50 kat koku sulandırmak. Çözümleri, en az 30 dakika şişelerde muvazene edelim. Her şişe koku maddesi buhar konsantrasyonu bilinmeyen olduğunu unutmayın, ancak sıvı faz koku konsantrasyonu bir fonksiyonu olarak değişecektir.
3. P silikon tıpa ile iki adet 18 gauge iğne takınrovide giriş ve çıkış portları. Şişe kullanımda değilken portlar takılmalıdır.

Bölüm 4: EOG ve analiz veri kaydetme

1. Kurban dekapitasyon tarafından takip CO ₂ ötenazi veya anestezik doz aşımı bir fare. Kafatası örten deri çıkarın ve sagittally orta hat boyunca baş iki eşit parçaya böler.
2. Montaj çanak, başın bir yarısında, iç tarafa monte edin. Konkalar maruz septum dikkatlice çıkarın.
3. Doku ile kayıt aşamasında monte edilmiş çanak yerleştirin. Konkalar kayıt konumu mikroskop altında merkezli olduğu için, sahne aynı hizaya getirin.
4. Konka yüzey nemlendirilmiş hava hava tankı üzerine çevirin. Pozisyon hava teslim tüp böylece kayıt yerden yaklaşık 10 mm uzaklıkta. Akış hızı ~ 600 ml / dak.
5. Low-pass filtre, 1 kHz ve 100X kazandıracağı DC modu (AC amplifikasyon EOG sinyali eserler neden olacaktır) amplifikatör ayarlayın.
6. Mikromanipülatörler Mount kayıt ve referans elektrotlar.
7. Montaj çanak kuyuya referans elektrot Alt ve doku elektrikle bağlı olduğu gibi modifiye Ringer solüsyonu ile kapatın.
8. Konka IIb veya III yüzeyine kayıt elektrot dikkatlice düşük. Elektrot ancak olfaktör epitelin yüzeyine dokunmayın! Elektrot epitel ile temas söz konusu olduğunda (örneğin bir elektrik devresi tamamlar) düz bir taban osiloskop görünecektir.
9. Odorant şişe hava teslim tüp yan bağlantı noktasına takın.
10. Bilgisayarda, bir stimülasyon protokolü başlatın. Veri elde etmek için örnekleme oranı, 2 kHz veya daha yüksek olmalıdır. Yazılım bir koku darbe tetikleyebilir ve kayıt başlayacaktır.
11. Tipik bir stimülasyon protokolü 100 msn bakliyat 1 sn aralığı ile ayrılmış eşleştirilmiş 100-msn süre tek darbe, ya da 10 saniye sürekli darbe olabilir.
12. Protokolleri arasındaki doku minimal adapte bu yüzden biraz zaman tanıyın. Bir dakika amil asetat ve 10 ^-3 M heptaldehyde sıvı konsantrasyonları için yeterli olur; yüksek konsantrasyonlarda az 5 dakika izin verir. Yüksek koku konsantrasyonu (sonunda bir doz-yanıt eğrisi gibi) teslim ettikten sonra artık koku tüp içinde kalabilir. % 95 etanol ile yıkayın ve hava tüpü ek doku örnekleri ile devam etmeden önce kuru.
13. Axograph yazılımı EOG sinyali önemli parametreleri ölçmek için araçları sağlar. Bu parametreleri yanıtı genlik, latans zirve zamanı ve fesih zaman sabitleri içerir. Bu, dijital daha fazla analiz önce 25 Hz'de izlerini filtre istenebilir.

Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1. EOG analiz için Parametreler. EOG çeşitli parametreleri yanıtı genlik, latans (uyaran uygulanan ve yanıt başlar arasındaki zaman), yükselme zamanını (başlangıcı arasındaki süre de dahil olmak üzere, fareler arasında karşılıklar karşılaştırma, özellikle yararlı tepki ve pik), tepe (stimülasyon başından itibaren yanıt zirvesine zaman) ve sabit fesih süresi (τ, tek bir üstel denklem yanıt çürüme aşamasında uygun belirlenen .) , Gecikme, yükselme zamanı, ve sabit bir zaman fesih olarak kinetik parametrelerin karşılaştırılması için, bu analizden önce tepkilerin tepe genlik normalleştirmek için tavsiye edilir.

Şekil 2. Temsilci farklı stimülasyon protokolleri altında sinyalleri EOG uyarılara yanıt olarak bir fare EOGs (a) Örnekler amil asetat artan konsantrasyonları ile. Panelin üst kısmında siyah bir çizgi odorant stimülasyon zamanlaması ve süresi gösterir. Efsaneye konsantrasyonları sıvı solüsyon konsantrasyonlarının. (B) Bir doz-cevap ilişkisi beş farelerden alınan ortalama. Hata çubukları,% 95 güven aralığı. Tepe genlik azalması, sık sık, çok yüksek kokusu konsantrasyonlarda görülmektedir. (C), eşleştirilmiş bir darbe stimülasyonuna yanıt olarak bir EOG bir örnek. Odorant tek bir kısa pulse birkaç saniye süren adaptasyon ortaya çıkarır. (D) 10 sn yanıt EOG bir örnek odorant stimülasyon sürdürmüştür. EOG sürekli odorant sunum sırasında duyarsızlaştırma gösterir.

Tartışmalar

Bu protokol açıklanan kurulum ile olfaktör epitel yüzeyinde odorant uyaranlara, tam odorant konsantrasyon ve dinamikleri bilinmiyor olsa bile, vahşi tip ve mutant fareler arasında karşılaştırma sağlayan doku hazırlıkları arasında tutarlı olacaktır. Çeşitli faktörler, özellikle kayıt yeri ve nemlendirilmiş hava akış hızı, EOG değişimler neden olabilir. Bakım benzer konumlarda aynı konka varyasyonu en aza indirmek için kayıt alınmalıdır. Bu başın aynı tarafında sürekli kayıt ve mikroskop, koku teslim tüp, ve doku örnekleri arasında hava tablo değişmeden üzerinde mikromanipülatörler ayak izi tutarak kolayca elde edilebilir. Buna ek olarak, aşırı doku diseksiyonu sonra kurumasını önlemek için doku örnekleri hemen nemlendirilmiş hava akışı içine yerleştirilmiş olmalıdır.

Fareler üzerinde EOG kayıtları da ^{7, 14, 15,} ya da baş zedelemeden ve ^{konkalar 16,} 17 üzerinde delinmiş küçük bir delik içine elektrod ekleme konkalar hazırlanan fare üzerindeki sıvı perfüzyon aparatı ile yürütülen olabilir . Her varyasyon EOG kayıt kendi güçleri vardır: Bu protokol açıklandığı gibi doku hazırlıkları hava fazlı kayıtları az miktarda bir kurulum gerektirmez ve yapmak kolay; bir sıvı perfüzyon cihazları kullanırken kayıtları farmakolojik reaktiflerin kullanımını kolaylaştırmak karşın birçok koku hidrofobik doğa koku teslim zordur; son olarak, kafa sağlam olduğu kayıtları 'yapay sniff' deneylerde kullanılabilir, elektrot yerleştirme konkalar tam maruz kaldığında daha zor olmasına rağmen.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air delivery tube	equipment	Custom Made		The barrel of a 1-mL syringe with a T-fitting can be used as a substitute
Air table	equipment	Newport Corp.	LW3030B-OPT
Amplifier	equipment	Warner Instruments	DP-301
Computer and Data Acquisition Software	equipment	Axograph 4.9.2 on Apple Macintosh		Updated versions of Axograph for Mac OS X and Windows are available from http://axographx.com/.
Butane torch	equipment			A crème brûlèe torch works well
Digitizer	equipment	Axon Instruments	Digidata 1322A
Dissecting Scope	equipment	Scienscope	SSZ
Electrode holder	equipment	Harvard Apparatus	64-1021
Magnetic Holding Devices (12 mm)	equipment	World Precision Instruments, Inc.	M10
Micromanipulators	equipment	World Precision Instruments, Inc.	M3301R M3301L
Micropipette Puller	equipment	Sutter Instrument Co.	P2000
Oscilloscope	equipment	Tektronix, Inc.	5110
Picospritzer III	equipment	Parker Hannifin Corporation
Silicone tubing	equipment	Nalge Nunc international
Specimen stage	equipment	Custom Made		Any small solid object can be used to elevate the mounting dish. Immobilize the dish with modeling clay.
18 gage needles	material	BD Biosciences	305195
2 oz. glass bottles	material	VWR international	16152-201
Glass capillaries	material	World Precision Instruments, Inc.	TW150F-6
Silicone stoppers size 16D	material	Chemware	D1069809
Silver wire	material	World Precision Instruments, Inc.	AGW1010
SylGuard 184	material	Dow Corning	SYLG184	From World Precision Instruments
Agarose	reagent	Invitrogen	15510-027
Amyl acetate	reagent	Aldrich	W504009
Calcium chloride (CaCl2)	reagent	Sigma-Aldrich	C-1016
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	reagent	Sigma-Aldrich	D5879
HEPES	reagent	Fisher Scientific	BP310
Heptaldehyde	reagent	Aldrich	H2120
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2+6H2O)	reagent	Sigma-Aldrich	M9272
Sodium chloride (NaCl)	reagent	JT Baker	3624-05
flowmeter	equipment	Gilmont Instruments	GF-2260