La administración oral de la rotenona con una sonda y Análisis de Imágenes de la alfa-sinucleína inclusiones en el sistema nervioso entérico

Resumen

La enfermedad de Parkinson se ha relacionado con la exposición a plaguicidas. Aquí se muestra un método para entregar los pesticidas mediante un tubo gástrico a la concentración deseada y un método para analizar su efecto en la acumulación de alfa-sinucleína en el sistema nervioso entérico.

Resumen

En la enfermedad de Parkinson (EP) de los pacientes, la patología asociada sigue un patrón característico implican entre otras cosas, el sistema nervioso entérico (SNE) ^1,2, el bulbo olfatorio (OB), el núcleo motor dorsal del vago (DMV) ^3, la intermediolateral núcleo de las ⁴ de la médula espinal y la sustancia negra, proporcionando la base para la puesta en escena neuropatológicos de la enfermedad ^4,5. La ENS y OB son las estructuras más expuestas nervioso y los primeros en verse afectados. Curiosamente, PD se ha relacionado con la exposición a plaguicidas ^6-8. Aquí se muestra en detalle dos métodos utilizados en nuestro estudio anterior ^9. Con el fin de analizar los efectos de la rotenona actúa localmente en el ENS, se administró utilizando una sonda rotenona a un año de edad C57/BL6 ratones. La rotenona es un pesticida muy utilizado que inhibe fuertemente complejo I mitocondrial ^10. Es muy lipofílicos y absorbe mal en el tracto gastrointestinal ^11. Nuestros resultados mostraron que la administración de 5 mg / kg de la rotenona no inhibió la actividad de complejo I mitocondrial en el músculo o en el cerebro. Por lo tanto, lo que sugiere que el uso de rotenona nuestro método de administración no cruzó el sistema hepatoportal y se actúa solamente en la ENS. Aquí se muestra un método para administrar los pesticidas con una alimentación por sonda y el protocolo de análisis de imágenes para analizar los efectos de los plaguicidas en la acumulación de alfa-sinucleína en la ENS. La primera parte muestra un método que permite la administración intragástrica de plaguicidas (rotenona) a una concentración deseada precisión. El segundo método muestra la imagen de un protocolo semi-automático de análisis para analizar la acumulación de alfa-sinucleína en la ENS utilizando un software de análisis de imagen.

Protocolo

1) la administración intragástrica de la rotenona

1. Pesa el animal.
2. Calcular el volumen total de la solución de rotenona / vehículo necesario. En este caso, 0,01 ml por gramo de peso del animal.
3. Cobro de una jeringa de 1 ml con el volumen calculado previamente de la solución de rotenona (0,625 mg / mL rotenona, el 4% y el 1,25 carboximetilcelulosa cloroformo%) o solución vehículo (4% carboximetilcelulosa y 1,25% cloroformo). En este caso corresponde a una dosis de rotenona 5 mg / kg.
4. Levante el ratón y, sosteniendo la cola del ratón con una mano, estirar la piel del cuello tirando de él con los dos primeros dedos de la otra mano.
5. Una vez que la cabeza se fija entre los dos dedos, es apoyarse en la palma de la mano y la coloque boca abajo. Fijar la cola con los dedos cuarto y quinto.
6. Mantener la cabeza hacia atrás, pulse el paladar para abrir la boca del ratón. Introducir la sonda suavemente en la boca. Es importante utilizar una aguja de alimentación forzada y no una aguja normal. Poco a poco, mover la sonda en la dirección del estómago lo suficientemente lejos. Esto evitará que el material consiguiendo en los pulmones.
7. Administrar la solución para la rotenona o el vehículo presionando suavemente el émbolo. Cuando esté terminado, poco a poco extraer la sonda.
8. Vuelva a colocar el animal en otra jaula hasta que todos los animales de una jaula se llevan a cabo.

2) Procedimientos de inmunotinción

1. Después del tratamiento, los ratones son anestesiados utilizando ketamina 100 mg / kg ip und Xylazin 10 mg / kg y perfusión intracardíaca con paraformaldehído al 4% en PBS.
2. Las tripas se extraen por la disección, y se coloca en el 15% de sacarosa durante la noche. Al día siguiente, el tejido se transfiere al 30% de sacarosa y se incuba de nuevo la noche a 4 ° C.
3. El tejido es colocado entonces en Tissue-Tek y se almacenan en un congelador de -80 º C hasta su uso.
4. El uso de un criostato, de 20 micras intestino secciones se transfieren a las diapositivas Superfrost.
5. El bloqueo y la inmunotinción procedimientos utilizando anticuerpos anti-βIII-tubulina y anti-alfa-sinucleína se realiza como se ha descrito previamente ^9.

3) Imagen de la alfa-sinucleína Inclusión Análisis

Se recomienda que una persona externa desconoce el origen de imágenes "realiza el análisis. Por lo tanto, los datos deben ser codificados. Análisis de imágenes se realizó utilizando el software FIJI.

1. Abra el archivo de imagen confocal. Luego, dividir los canales de modo que es posible trabajar en cada canal de forma independiente.
2. Cerca de los canales que no se van a utilizar y seleccionar Analizar> Definición de la escala y establecer el tamaño del pixel a 1. Establecer la distancia conocida a 0,13 (esto dependerá de los objetivos y la resolución utilizada) y haga clic en el global. El tamaño de la imagen se mostrará ahora en micrones.
3. Seleccione la alfa-sinucleína del canal y seleccione ganglionares, asegúrese de que la selección encierra el ganglio en todos los cortes.
4. Imagen de prensa> Duplicar para duplicar la imagen. Con el ganglio seleccionado, sólo una imagen del tamaño de los ganglios se duplicará.
5. Pulse Editar> Borrar fuera. La parte de la imagen, fuera de la región seleccionada se convertirá en negro.
6. Duplicar la imagen de nuevo para determinar en qué tan bien los pasos posteriores del procedimiento fue. Las imágenes que tienen una señal al ruido de fondo no relación se debe utilizar para el análisis de imágenes.
7. Seleccione Imagen> Ajustes> Umbral y luego seleccione MaxEntropy. A continuación, se mueven sobre las rebanadas de la imagen recortada y la original para garantizar que el procedimiento fue bien. El umbral de entropía selecciona un nivel de intensidad de señal basado en el histograma de la imagen y sólo los píxeles con intensidades superiores a este umbral se muestran en una imagen blanco sobre negro.
8. Seleccione Proceso, a continuación, haga clic en liso. Este paso se transforma los bordes de las imágenes pixeladas en los bordes lisos.
9. Seleccione Proceso, a continuación, haga clic en binario, y elija la opción de binarios. La imagen se muestra como un negro sobre blanco la imagen.
10. Duplicar la imagen para realizar el siguiente paso en la imagen duplicada.
11. Haga clic en Análisis> Análisis de partículas. A continuación, seleccione Mostrar: Contornos y haga clic en Resumir. El resto de ajustes se deben a falta de hojas. Esta función reconoce el número total de píxeles con una señal y los que se agrupan. La superficie total de píxeles de la señal más el número de grupos de píxeles y el tamaño medio se informó.
12. Comparar y seleccionar la mayor porción que se ajusta bien. El corte será marcado.
13. Copia de la tabla de datos con el total de la alfa-sinucleína superficie, el número de inclusiones y el tamaño medio de partícula. Pegue los datos en una hoja de cálculo Excel o anotado en otra parte.
14. Volver a Fiji y encontrar el trozo seleccionado previamente en el canal de β-tubulina, y seleccionarlo.
15. Seleccionar el área del ganglio y haga clic en Analizar a continuación, seleccione Medir. Otra tabla aparecerá mostrando elsuperficie total de los ganglios.
16. Extraer los datos de la tabla de la hoja de Excel, cerca de la medición de la alfa-sinucleína o copiarlo en otra parte.
17. El uso de Excel, se dividen los diferentes parámetros obtenidos en la medición de la alfa-sinucleína en la superficie del ganglio para obtener el total de alfa-sinucleína número de superficie y la inclusión normalizada por el tamaño del ganglio.

4) Los resultados representativos

Cuando protocolo de administración de alimentación forzada se lleva a cabo correctamente las molestias para el animal son mínimas. El tratamiento con esta concentración de rotenona permite un efecto local de la rotenona en la ENS, sin los niveles de la rotenona en la sangre y no la inhibición de los músculos o el cerebro complejo I mitocondrial, incluso después de 1,5 meses de tratamiento (ver figura 1). Si el análisis de imágenes se realiza correctamente un análisis riguroso de la alfa-sinucleína patrón debe ser posible. Se da datos fiables sobre la cantidad total de la alfa-sinucleína (superficie total), la alfa-sinucleína en el patrón de células (número de inclusiones) y la presencia de alfa-sinucleína inclusiones (tamaño inclusión) (Figura 2).

Figura 1. Disfunción motora en ratones tratados con rotenona sin detección de la rotenona en la sangre o del SNC. Un estándar, (50 ng / ml) y cromatograma de las muestras de cerebro de 20, 10 y 5 mg / kg los ratones tratados. B y C, la cuantificación de los niveles de la rotenona en la sangre (B) y sistema nervioso central (C). B, los niveles de una , 2 y 3 horas después del tratamiento. Los ratones se dividieron en tres grupos (n = 3) y tratados con 2,5, 5, 10 y 20 mg / kg rotenona (n = 3), 300 l de sangre se extrajo de 1, 2 y 3 después de la administración y la rotenona agruparon para El análisis por HPLC. C, los ratones fueron tratados durante una semana una vez al día con 5 (n = 3), 10 (n = 3) y 20 (n = 1) mg / kg rotenona, el cerebro y el tallo cerebral se obtuvieron 1 y 2 horas después la última administración y preparados para el análisis por HPLC. D, complejo I mitocondrial actividad en muestras de músculo y el cerebro de los ratones tratados 1,5 meses.

Figura 2. Rotenona administrada localmente induce la fosforilación de la alfa-sinucleína, la acumulación y agregación con gliosis en los ganglios de la ENS. (Barras de escala de 20 micras). A, B, C, anti-tubulina βIII, alfa-sinucleína y la DAPI en el duodeno (B) y el íleon ( A, C) secciones. Flecha en B, 1,5 meses de tratamiento indujo un aumento de la alfa-sinucleína patrón punteado dentro de los ganglios del sistema nervioso entérico, en comparación con 3 controles meses (A). Flecha en C, la formación de 3 meses de tratamiento inducida de más alfa-sinucleína inclusiones (ø> 6 mm). D, la tinción de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos anti-alfa-sinucleína, S tioflavina y DAPI. Flecha en D, sólo tres meses los ratones tratados mostraron una agregación de estos grandes acumulaciones de alfa-sinucleína. E, E ', E'', la imagen de los pasos análisis y cuantificación. E, ejemplo de la imagen que se utiliza en la cuantificación mostrando un ganglio ENS immunostained contra la alfa-sinucleína muestra inclusiones diferentes. E ', ejemplo de la imagen obtenida tras el protocolo de análisis de imagen. E'', la superposición entre algunas de las inclusiones original (verde) y la representación obtenida tras la realización del protocolo (líneas amarillas). FG, la cuantificación del experimento se muestra en AC se realizó mediante la segmentación automática basada en la entropía y los métodos de umbralización. Solo asterisco, p <0,05, y el doble asterisco, p <0,01. F, cada columna representa el total de la alfa-sinucleína superficie / superficie del ganglio. G, cada columna representa el número total de alfa-sinucleína inclusiones / superficie ganglionares. Todos los gráficos muestran la media ± SEM

Discusión

La administración intragástrica se ha realizado previamente ^12. Sin embargo, según el manuscrito de Inden, rotenona se administró la sal disuelta en carboximetilcelulosa 0,5% de sodio (CMSS) por sí sola. La rotenona es una sustancia liphophylic alta. Por lo tanto, la rotenona no puede ser disuelto en el CMSS 0,5% solo y se precipitará si se hace así. El uso de cloroformo crea una suspensión rotenona uniformemente distribuida para evitar la precipitación. Además, debido a las mayores concentraciones ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Germany
Chloroform	Carl Roth GmbH	3313.1	Germany
Carboxymethylcellulose	Sigma-Aldrich	C5678	Germany
Gavage 1,2 mm x 60 mm	Unimed		Switzerland
LSM 510	Carl Zeiss, Inc.
FIJI	http://pacific.mpi-cbg.de