La somministrazione orale di Rotenone utilizzando un Gavage e Image Analysis di alfa-sinucleina inclusioni nel sistema nervoso enterico

Riepilogo

Morbo di Parkinson è stata correlata all'esposizione ai pesticidi. Qui vi mostriamo un metodo per fornire pesticidi utilizzando un tubo gastrico alla concentrazione desiderata e un metodo per analizzare il loro effetto in alfa-sinucleina accumulo nel sistema nervoso enterico.

Abstract

Nella malattia di Parkinson (PD) pazienti, la patologia associata segue un modello caratteristico che coinvolge tra l'altro il sistema nervoso enterico (ENS) ^1,2, il bulbo olfattivo (OB), il nucleo motore dorsale del vago (DMV) ^3, l'intermedio- nucleo dei ⁴ midollo spinale e la substantia nigra, fornendo la base per la messa in scena neuropatologici della malattia ^4,5. L'ENS e l'OB sono le strutture più esposte nervoso e le prime ad essere colpite. È interessante notare che PD è stata correlata ai pesticidi ^6-8. Qui vi mostriamo nel dettaglio due metodi utilizzati nel nostro studio precedente ^9. Per analizzare gli effetti del rotenone agire localmente sulle ENS, abbiamo somministrato rotenone utilizzando una sonda gastrica per un anno vecchio C57/BL6 topi. Rotenone è un pesticida largamente usato che inibisce fortemente complesso mitocondriale I ^10. E 'altamente lipofile e scarsamente assorbito nel tratto gastrointestinale ^11. I nostri risultati hanno mostrato che la somministrazione di 5 mg / kg di rotenone non ha inibito l'attività Complesso I mitocondriale nel muscolo o del cervello. Così, suggerendo che usando il nostro metodo di rotenone amministrazione non ha attraversato il sistema epatoportale e agiva esclusivamente sulla ENS. Qui vi mostriamo un metodo di amministrare con una sonda gastrica pesticidi e il protocollo di analisi delle immagini utilizzate per analizzare gli effetti del pesticida in alfa-sinucleina accumulo nel ENS. La prima parte illustra un metodo che consente la somministrazione intragastrica di pesticidi (rotenone) ad una concentrazione desiderata precisa. Il secondo metodo mostra una semi-automatica protocollo di analisi delle immagini per analizzare alfa-sinucleina accumulo nel ENS utilizzando un software di analisi dell'immagine.

Protocollo

1) Amministrazione intragastrico di Rotenone

1. Pesare l'animale.
2. Calcolare il volume totale di rotenone / veicolo soluzione necessaria. In questo caso 0,01 ml per grammo di peso animale.
3. Caricare una siringa da 1 ml con il volume già calcolato di soluzione rotenone (0,625 mg / mL rotenone, 4% carbossimetilcellulosa cloroformio e 1,25%) o soluzione di veicoli (4% carbossimetilcellulosa cloroformio e 1,25%). In questo caso corrisponde ad un 5 mg / kg dose di rotenone.
4. Raccogliete il mouse e, tenendo la coda di topo con una mano, allungare la pelle del collo tirandolo con le prime due dita dell'altra mano.
5. Una volta che la testa è fissato tra le due dita, appoggiate il palmo della mano e girarlo a testa in giù. Fissare la coda con il quarto e quinto dito.
6. Mantenere la testa verso la parte posteriore, premere il palato per aprire la bocca del mouse. Introdurre delicatamente la sonda gastrica in bocca. E 'importante utilizzare un ago sonda gastrica e non un ago normale. Lentamente, spostare la sonda gastrica nella direzione dello stomaco abbastanza lontano. Ciò eviterà materiale trovato nei polmoni.
7. Somministrare la soluzione rotenone o di un veicolo premendo delicatamente l'embolo. Una volta completato, lentamente estrarre la sonda gastrica.
8. Posizionare il nuovo animale in un'altra gabbia fino a quando tutti gli animali da una gabbia è fatto.

2) L'immunocolorazione Procedure

1. Dopo il trattamento, i topi vengono anestetizzati utilizzando Ketamin 100 mg / kg und Xylazin 10 mg / kg ip e intracardially perfusi con paraformaldeide 4% in PBS.
2. Il fegato viene estratto da dissezione, e collocato nel 15% saccarosio durante la notte. Il giorno successivo, il tessuto viene trasferito al 30% di saccarosio e incubate di nuovo una notte a 4 ° C.
3. Il tessuto viene poi messo in tessuto-tek e conservati in un congelatore ° -80 C fino all'utilizzo.
4. Utilizzando un criostato, 20 micron intestino sezioni vengono trasferite alle diapositive Superfrost.
5. Blocco e immunostaining procedure utilizzando anti-βIII-tubulina e anti-alfa-sinucleina anticorpi vengono poi eseguite come descritto in precedenza ^9.

3) Analisi dell'immagine alfa-sinucleina Inclusione

Si raccomanda che una persona esterna a conoscenza di origine immagini 'esegue l'analisi. Pertanto, i dati devono essere codificati. Analisi delle immagini è stata effettuata utilizzando il software FIGI.

1. Aprire il file immagine confocale. Poi, dividere i canali in modo che sia possibile lavorare su ogni canale in modo indipendente.
2. Chiudere quei canali che non stanno per essere utilizzare e selezionare Analisi> Imposta Scala e impostare la dimensione del pixel a 1. Impostare la distanza nota a 0,13 (questo dipenderà l'obiettivo e la risoluzione utilizzata) e cliccare su globale. La dimensione dell'immagine sarà ora mostrato in micron.
3. Seleziona alfa-sinucleina e selezionate ganglio, assicurarsi che la selezione racchiude il ganglio in tutte le sezioni.
4. Image Press> Duplica per duplicare l'immagine. Con il ganglio selezionato, solo un'immagine delle dimensioni del ganglio verranno duplicati.
5. Premere Modifica> Fuori Cancella. La parte dell'immagine di fuori della regione selezionati diventeranno neri.
6. Duplicare l'immagine di nuovo per determinare in fasi successive come pure la procedura è andato. Le immagini che hanno un segnale alto in rapporto al rumore di fondo non deve essere utilizzato per l'analisi delle immagini.
7. Seleziona Immagine> Regolazioni> Soglia e quindi selezionare MaxEntropy. Quindi spostare sulle fette nella immagine ritagliata e l'originale per garantire che la procedura è andata bene. La soglia entropica seleziona un livello di segnale di intensità in base alla istogramma dell'immagine e solo i pixel con intensità superiore a questa soglia sarà visualizzato in un bianco su un'immagine nera.
8. Selezionare Elabora, quindi fare clic su Smooth. Questo passo pixeled trasforma i bordi delle immagini in bordi lisci.
9. Selezionare Elabora, poi clicca sul binario, e scegliete Crea binari. L'immagine verrà visualizzata come immagine nero su bianco.
10. Duplica immagine per eseguire il passaggio successivo sull'immagine duplicato.
11. Fare clic su Analizza> Analizzare particelle. Quindi selezionare Mostra: Contorni e cliccare su Riassumere. Il resto delle impostazioni dovrebbe essere lasciato in default. Questa funzione riconosce il numero totale di pixel con un segnale e quelli che sono raggruppati insieme. La superficie totale di pixel con il segnale più il numero di gruppi di pixel e la dimensione media sono segnalati.
12. Confrontare e selezionare la fetta più grande che si adatta bene. La fetta sarà segnato.
13. Copiare la tabella di dati con il totale alfa-sinucleina superficie, il numero di inclusioni e la dimensione media delle particelle. Incollare i dati in un foglio excel o annotato altrove.
14. Torna a FIJI e trovare la fetta precedentemente selezionato nella β-tubulina di canale, e selezionarlo.
15. Seleziona area ganglio e cliccare su Analizza quindi selezionare Misura. Un'altra tabella apparirà mostrando lasuperficie totale del ganglio.
16. Estrarre i dati dalla tabella al foglio di eccellere nei pressi della alfa-sinucleina misura o copiare il basso altrove.
17. Utilizzando Excel, dividere i vari parametri ottenuti nelle alfa-sinucleina misura dalla superficie ganglio di ottenere totale alfa-sinucleina numero superficie e inclusione normalizzato in base alle dimensioni ganglio.

4) Rappresentante Risultati

Quando il protocollo amministrazione sonda gastrica viene eseguita correttamente i disagi per l'animale sono minimi. Trattamento con questa concentrazione di rotenone permette un effetto locale di rotenone sulle ENS senza rotenone livelli nel sangue e nessuna inibizione del complesso muscolo o cervello mitocondriale ho anche dopo 1,5 mesi di trattamento (vedi Figura 1). Se l'analisi delle immagini viene eseguita correttamente una rigorosa analisi di alfa-sinucleina modello dovrebbe essere possibile. Fornisce dati affidabili sulla quantità totale di alfa-sinucleina (superficie totale), alfa-sinucleina modello nella cella (numero di inclusioni) e la presenza di alfa-sinucleina inclusioni (dimensione inclusione) (Figura 2).

Figura 1. Disfunzione motoria in topi trattati con rotenone senza riconoscimento del rotenone nel sangue o nel sistema nervoso centrale. A, di serie (50 ng / mL) e cromatogramma da campioni di cervello di 20, 10 e 5 mg / kg topi trattati. B e C, la quantificazione dei livelli di rotenone nel sangue (B) e sistema nervoso centrale (C). B, i livelli di sangue 1 , 2 e 3 ore dopo il trattamento. I topi sono stati divisi in tre gruppi (n = 3) e trattati con 2,5, 5, 10 e 20 mg / kg rotenone (n = 3), 300 ml di sangue è stato estratto ore 1, 2 e 3 dopo la somministrazione rotenone e raccolto insieme per analisi HPLC. C, i topi sono stati trattati per una settimana una volta al giorno con 5 (n = 3), 10 (n = 3) e 20 (n = 1) mg / kg rotenone, cervello e tronco encefalico sono stati estratti 1 e 2 ore dopo ultima somministrazione e preparati per l'analisi HPLC. D, Complesso I mitocondriale attività in campioni di muscolo e nel cervello dei topi trattati con 1,5 mesi.

Figura 2. Rotenone amministrato localmente induce alfa-sinucleina fosforilazione, l'accumulo e l'aggregazione con gliosi nei gangli ENS. (Bar scala 20 micron). A, B, C, anti βIII-tubulina, l'alfa-sinucleina e colorazione DAPI nel duodeno (B) e ileo ( A, C) sezioni. Freccia in B, 1,5 mesi di trattamento ha indotto un aumento di alfa-sinucleina modello puntata all'interno dei gangli del sistema nervoso enterico rispetto ai 3 controlli mesi (A). Freccia in C, 3 mesi di trattamento ha indotto la formazione di grandi alfa-sinucleina inclusioni (ø> 6 micron). D, colorazione di immunofluorescenza utilizzando anticorpi anti-alfa-sinucleina, Thioflavine S e DAPI. Freccia in D, solo 3 mesi i topi trattati hanno mostrato l'aggregazione di più questi alfa-sinucleina accumuli. E, E ', E'', immagine passi quantificazione analisi. E, esempio di immagine utilizzati nel quantificazione mostrando un ganglio ENS immunostained contro l'alfa sinucleina mostrando inclusioni diverse. E ', esempio di immagine ottenuta dopo il protocollo di analisi delle immagini. E'', sovrapposizione tra alcune delle inclusioni originale (verde) e la rappresentazione ottenuto dopo aver eseguito il protocollo (linee gialle). FG, quantificazione di questo esperimento mostrato in AC è stata fatta utilizzando la segmentazione automatica e l'entropia metodi basati soglia. Singolo asterisco, P <0,05, e doppio asterisco, P <0,01. F, ogni colonna rappresenta il totale di alfa-sinucleina superficie / ganglio superficie. G, ogni colonna rappresenta il numero totale di alfa-sinucleina inclusioni / superficie ganglio. Tutti i grafici mostrano media ± sem

Discussione

Amministrazione intragastrica è stato precedentemente effettuato ^12. Tuttavia, secondo il manoscritto Inden, il rotenone è stato somministrato sciolto in carbossimetilcellulosa sale dello 0,5% di sodio (CMSS) da solo. Rotenone è una sostanza ad alta liphophylic. Pertanto, rotenone non può essere sciolto in 0,5% CMSS da solo e si precipitano se fatto così. L'uso del cloroformio crea una sospensione rotenone distribuito uniformemente evitando precipitazioni. Inoltre, a causa della maggiore concentrazio...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Germany
Chloroform	Carl Roth GmbH	3313.1	Germany
Carboxymethylcellulose	Sigma-Aldrich	C5678	Germany
Gavage 1,2 mm x 60 mm	Unimed		Switzerland
LSM 510	Carl Zeiss, Inc.
FIJI	http://pacific.mpi-cbg.de