אוראלית של Rotenone באמצעות Gavage וניתוח מקדימה של Alpha-synuclein תכלילים במערכת העצבים enteric

Summary

מחלת פרקינסון כבר קשור לחשיפה לחומרי הדברה. כאן אנו מציגים שיטה כדי לספק חומרי הדברה באמצעות צינור קיבה בריכוז הרצוי שיטה לנתח את ההשפעה שלהם הצטברות אלפא synuclein במערכת העצבים enteric.

Abstract

ב (PD) ומחלת פרקינסון המטופלים, את הפתולוגיה הקשורה כדלקמן דפוס אופייני מעורבים בין היתר ^1,2 enteric העצבים (ENS) מערכת, את הנורה חוש הריח (OB), הגרעין מנוע הגבי של התועה (משרד הרישוי) ^3, intermediolateral גרעין של ⁴ חוט השדרה ואת nigra substantia, שסיפק את הבסיס ביים את neuropathological של המחלה ^4,5. ENS ו OB הם מבנים העצבים חשופים ביותר הראשונים להיות מושפעים. מעניין, פ"ד כבר הקשורים לחשיפה לחומרי הדברה ^6-8. כאן אנחנו מראים בפירוט שתי שיטות השתמשו במחקר הקודם שלנו ^9. כדי לנתח את ההשפעות של rotenone משחק מקומי על ENS, אנו rotenone מנוהל באמצעות gavage כדי שנה אחת C57/BL6 עכברים ישנים. Rotenone היא שימוש נרחב בחומרי הדברה, כי בתוקף מעכב קומפלקס המיטוכונדריה אני ^10. זה lipophylic מאוד ונספג היטב את מערכת העיכול ^11. התוצאות שלנו הראו כי הממשל של 5 מ"ג / ק"ג של rotenone לא לעכב קומפלקס המיטוכונדריה אני בפעילות השריר או המוח. לפיכך, טוען כי באמצעות שיטת הממשל שלנו rotenone לא לחצות את מערכת hepatoportal והיה פועל אך ורק על ENS. כאן אנו מציגים שיטה לנהל הדברה באמצעות gavage ואת פרוטוקול ניתוח תמונת להשתמש כדי לנתח את ההשפעות של חומרי הדברה ב הצטברות אלפא synuclein ב ENS. החלק הראשון מציג שיטה המאפשרת ניהול intragastric של חומרי הדברה (rotenone) בריכוז המדויק הרצוי. השיטה השנייה מראה חצי אוטומטי ניתוח התמונה פרוטוקול לנתח אלפא synuclein הצטברות של ENS באמצעות תוכנת ניתוח התמונה.

Protocol

1) מינהל Intragastric של Rotenone

1. לשקול את בעל החיים.
2. חשב את הנפח הכולל של פתרון rotenone / רכב הצורך. במקרה זה 0.01 מ"ל לגרם משקל בעל החיים.
3. טעינת מזרק 1 מ"ל עם נפח של פתרון מחושב בעבר rotenone (0.625 מ"ג / מ"ל ​​rotenone, carboxymethylcellulose 4% ו 1.25% כלורופורם) או פתרון הרכב (carboxymethylcellulose 4% ו 1.25% כלורופורם). במקרה זה מתאים במינון מ"ג / ק"ג 5 rotenone.
4. תרימי את העכבר, מחזיק בזנבו של עכבר ביד אחת, למתוח את העור של הצוואר ע"י משיכת אותו עם שתי האצבעות הראשונות מצד שני.
5. לאחר ראש קבוע בין שתי אצבעות, משעינה אותם על כף היד ולהפוך אותו הפוך. תקן את הזנב באמצעות האצבעות הרביעית והחמישית.
6. שמירה על הראש לכיוון הגב, לחץ על החיך לפתוח את הפה של העכבר. בעדינות להכניס את gavage בפה. חשוב להשתמש במחט gavage ולא מחט רגילה. לאט לאט להזיז את gavage לכיוון הבטן רחוק מספיק. זה ימנע מקבל חומר הריאות.
7. ניהול הפתרון rotenone או הרכב בעדינות על ידי לחיצה על תסחיף. כאשר יושלם, לאט לחלץ את gavage.
8. הנח את גב חיה בכלוב אחר עד שכל החיות מכלוב אחד נעשים.

2) Immunostaining נהלים

1. בעקבות הטיפול, עכברים מורדמים באמצעות Ketamin 100 מ"ג / ק"ג und Xylazin 10 מ"ג / ק"ג ו - ip perfused intracardially עם Paraformaldehyde 4% ב-PBS.
2. אומץ המחולצים מכן על ידי לנתיחה, והושמו סוכרוז 15% בין לילה. למחרת, הרקמה מועברת סוכרוז 30% ו מודגרות שוב לילה בשעה 4 ° C.
3. רקמה ממוקם אז רקמות-Tek ומאוחסנים במקפיא -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
4. שימוש cryostat, 20 מיקרון המעי חתכים מועברים שקופיות Superfrost.
5. חסימת immunostaining ההליכים באמצעות נוגדנים נגד βIII-טובולין ואנטי אלפא synuclein מבוצעות אז ⁹ שתואר לעיל.

3) תמונה Alpha-synuclein הכללה ניתוח

מומלץ כי אדם חיצוני מודעים מוצא "תמונות מבצעת את הניתוח. לפיכך, הנתונים צריכה להיות מוסדרת. ניתוח התמונה בוצעה באמצעות תוכנה פיג'י.

1. פתח את קובץ התמונה confocal. ואז, לפצל את הערוצים כך אפשר לעבוד על כל ערוץ בנפרד.
2. סגור את הערוצים שלא הולך להיות שימוש ובחר נתח> הגדרת קנה המידה לקביעת גודל פיקסל 1. הגדר את המרחק ידוע 0.13 (זה יהיה תלוי המטרה לבין ההחלטה בשימוש) ולחץ על העולמית. הגודל של התמונה תוצג כעת ב מיקרון.
3. בחר אלפא synuclein ערוץ ובחר הגנגליון, ודא כי הבחירה סוגר את מרכז העצבים של כל הפרוסות.
4. תמונה לעיתונות> שכפל לשכפל את התמונה. עם הגנגליון שנבחר, רק תמונה בגודל של הגנגליון יהיו כפולות.
5. לחצו על Edit> Clear בחוץ. החלק של התמונה מחוץ לאזור הנבחר יהפוך שחור.
6. שכפל את התמונה שוב כדי לקבוע צעדים מאוחר יותר כמה טוב ההליך הלך. תמונות שיש להם אות לרעש גבוה יחס הרקע לא אמור לשמש לניתוח התמונה.
7. בחר <תמונה התאם סף> ולאחר מכן בחר MaxEntropy. ואז לעבור מעל את פרוסות בתמונה קצוץ המקורית על מנת להבטיח כי ההליך יתנהל כשורה. סף entropic בוחר אות עוצמת רמת מבוסס על היסטוגרמה את התמונה רק את אלה פיקסלים עם עוצמות גבוהות מהסף הזה יוצג לבן מעל התמונה השחורה.
8. בחר תהליך, ואז ללחוץ על חלקות. צעד זה הופך את הקצוות pixeled של תמונות קצוות חלקים.
9. בחר תהליך, ואז ללחוץ על בינארי, ובחרו לעשות בינארי. התמונה תוצג כמו שחור לבן מעל התמונה.
10. שכפל תמונה לביצוע הצעד הבא על התמונה המשוכפלת.
11. לחצו על Analyze> נתח חלקיקים. לאחר מכן בחר הצג: מתאר ולחץ על סכם. שאר ההגדרות יש עלים של ברירת המחדל. פונקציה זו מזהה את המספר הכולל של פיקסלים עם אות ואלה מקובצים יחד. השטח הכולל של פיקסלים עם אות ועוד מספר קבוצות של פיקסלים בגודל ממוצע מדווחים.
12. השווה ובחר את הפרוסה הגדולה ביותר זה מתאים היטב. פרוסה יסומנו.
13. העתק את טבלת נתונים עם המשטח אלפא synuclein הכולל, מספר תכלילים ואת גודל החלקיקים מתכוון. הדבק את הנתונים לתוך גיליון אלקטרוני של Excel או המבואר במקום אחר.
14. חזור אל פיג'י ולמצוא את הפרוסה שנבחרו קודם לכן בערוץ-β טובולין, ובחר בה.
15. בחר אזור הגנגליון ולחץ על נתח ולאחר מכן בחר מדוד. שולחן נוסף יופיע מראה אתהשטח הכולל של הגנגליון.
16. חלץ את הנתונים מהטבלה לגיליון Excel ליד מדידה אלפא synuclein או להעתיק אותו למקום אחר.
17. באמצעות Excel, לחלק את פרמטרים שונים המתקבלים במדידה אלפא synuclein על ידי השטח הגנגליון לקבל סך אלפא synuclein השטח הכללת מספר מנורמל לפי גודל גנגליון.

4) נציג תוצאות

כאשר פרוטוקול הממשל gavage מבוצע כהלכה את הנוחות עבור החיה הן מינימליות. טיפול באמצעות ריכוז rotenone מאפשר השפעה מקומית של rotenone על ENS ללא רמות rotenone בדם שום עכבות של קומפלקס שרירים או מוח המיטוכונדריה אני גם אחרי 1.5 חודשים של טיפול (ראה איור 1). אם ניתוח התמונה מבוצעת כהלכה ניתוח קפדני של דפוס אלפא synuclein צריך להיות אפשרי. זה נותן מידע אמין על הסכום הכולל של אלפא synuclein (השטח הכולל), אלפא synuclein דפוס בתא (מספר תכלילים) ואת הנוכחות של אלפא synuclein תכלילים (גודל הכללה) (איור 2).

באיור 1. תפקוד מוטורי ב rotenone העכברים שטופלו ללא זיהוי של rotenone בדם או במערכת העצבים המרכזית. , תקן (50 ng / mL) ו chromatogram דגימות מוח של 20, 10 ו - 5 מ"ג / ק"ג העכברים שטופלו. B ו-C, כימות של רמות rotenone בדם (B) CNS (C). B, בדם 1 , 2 ו - 3 שעות לאחר הטיפול. העכברים חולקו לשלוש קבוצות (n = 3) ו שטופלו 2.5, 5, 10 ו - 20 מ"ג / ק"ג rotenone (n = 3), 300 μL של דם הופק שעות 1, 2 ו -3 לאחר מתן rotenone ונקווה יחד ניתוח HPLC. C, עכברים שטופלו למשך שבוע פעם ביום עם 5 (n = 3), 10 (n = 3) ו -20 (n = 1) מ"ג / ק"ג, rotenone המוח המוח חולצו 1 ו - 2 שעות לאחר הממשל האחרון לקראת ניתוח HPLC. D, קומפלקס פעילות המיטוכונדריה אני בדגימות שריר המוח של 1.5 חודש העכברים שטופלו.

איור 2. Rotenone מנוהל מקומית גורם אלפא synuclein, זירחון הצטברות צבירה עם דבקת בגרעיני ENS. (ברים בהיקף 20 מיקרומטר). A, B, C, אנטי βIII-טובולין, אלפא synuclein והכתים DAPI תריסריון (B) מעי ( A, C) סעיפים. חץ ב ', 1.5 חודשים בטיפול המושרה דפוס גדל אלפא synuclein punctate בתוך הגרעינים enteric מערכת העצבים בהשוואה שולטת 3 חודשים (A). חץ ב-C, 3 חודשים היווצרות טיפול המושרה של אלפא synuclein תכלילים גדול (O> 6 מיקרומטר). D, מכתים immunofluorescence באמצעות אנטי אלפא synuclein, Thioflavine S ו DAPI. חץ ב ד ', רק 3 חודש העכברים שטופלו הראה צבירה של אלה אלפא synuclein הצטברויות גדולות יותר. E, ה', ה'', ניתוח התמונה צעדים כימות. E, למשל תמונה של המשמש כימות מראה הגנגליון ENS immunostained נגד אלפא synuclein מראה תכלילים שונים. ה ', למשל הדימוי המתקבל לאחר פרוטוקול ניתוח התמונה. E'', חפיפה בין כמה תכלילים המקורי (ירוק) ועל ייצוג המתקבל לאחר ביצוע פרוטוקול (קווים צהובים). מהשדה, כימות של הניסוי שמוצג AC נעשה באמצעות פילוח אוטומטי אנטרופיה שיטות מבוססות thresholding. Single-כוכבית, P <0.05, פעמיים כוכבית, P <0.01. F, כל עמודה מייצגת סך אלפא synuclein משטח / הגנגליון פני השטח. G, כל עמודה מייצגת את המספר הכולל של אלפא synuclein תכלילים / משטח גנגליון. כל הגרפים מראים ממוצע ± SEM

Discussion

הממשל Intragastric שבוצעה בעבר ^12. עם זאת, על פי כתב היד של Inden, rotenone היה מנוהל מומס מלח 0.5% carboxymethylcellulose נתרן (CMSS) לבד. Rotenone הוא חומר liphophylic גבוהה. לכן, rotenone לא יכול להיות מומס CMSS 0.5% בלבד ויהיה להאיץ אם נעשה כך. השימוש כלורופורם יוצר ההשעיה rotenone מופץ באופן שווה הימנעות משקעים...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Germany
Chloroform	Carl Roth GmbH	3313.1	Germany
Carboxymethylcellulose	Sigma-Aldrich	C5678	Germany
Gavage 1,2 mm x 60 mm	Unimed		Switzerland
LSM 510	Carl Zeiss, Inc.
FIJI	http://pacific.mpi-cbg.de