El uso de un ensayo de microarrays Pan-viral (Virochip) a la pantalla de muestras clínicas de los patógenos virales

Resumen

El Virochip es un microarray de pan-viral diseñada para detectar de forma simultánea todos los virus conocidos, así como nuevos virus sobre la base de la homología de secuencia conservada. Aquí se demuestra cómo ejecutar un ensayo de Virochip para analizar las muestras clínicas para determinar la presencia de virus conocidos y desconocidos.

Resumen

El diagnóstico de la causa viral de muchas enfermedades infecciosas es difícil debido a la secuencia de la diversidad inherente a los virus, así como la aparición continua de nuevos patógenos virales, como el coronavirus del SRAS y 2009, la pandemia del virus H1N1 de la gripe, que no son detectables por los métodos tradicionales. Para enfrentar estos desafíos, ya hemos desarrollado y validado una plataforma de microarrays pan-viral llamada Virochip con la capacidad de detectar todos los virus conocidos, así como nuevas variantes sobre la base de la homología de secuencia conservada ^1. Utilizando el Virochip, hemos identificado la gama completa de los virus asociados con las infecciones respiratorias, incluyendo los casos de enfermedades inexplicables crítico en los pacientes hospitalizados, con una sensibilidad igual o superior a ^5.2 convencionales de ensayos clínicos. El Virochip también se ha utilizado para identificar nuevos virus, incluyendo el coronavirus del SRAS ^6,7, un clado rinovirus novela ^5, XMRV (un retrovirus relacionados con el cáncer de próstata) ^8, bornavirus aviar (la causa de una enfermedad degenerativa en los loros) ^9, y una novela Cardiovirus en niños con enfermedades respiratorias y diarreicas ^10. La versión actual de la Virochip ha sido portado a una plataforma de microarrays de Agilent y consta de ~ 36.000 sondas derivadas de más de ~ 1.500 virus en el GenBank de diciembre de 2009. Aquí nos demuestran los pasos a seguir en el procesamiento de un ensayo de Virochip de principio a fin (~ 24 horas el tiempo de entrega), incluyendo la extracción de ácidos nucleicos de muestras, amplificación por PCR utilizando cebadores aleatorios, la incorporación de un colorante fluorescente, y la hibridación de microarrays, la exploración y el análisis.

Protocolo

Los pasos de la prueba Virochip incluyen (1) la extracción de ácidos nucleicos a partir de muestras clínicas, (2) transcripción inversa del ARN extraído y 2 ^º capítulo de la síntesis de ADNc, (3) amplificación por PCR de cDNA preparada al azar, (3) la incorporación Cy3 tinte fluorescente (4), la hibridación de materiales etiquetados para los microarrays Virochip, y (5) de exploración y el análisis (Figura 1). El protocolo se muestra a continuación demuestran el uso de la prueba Virochip en una muestra de exudado nasal de un niño con una enfermedad similar a la influenza.

Secuencias de los cebadores

Primer A 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-(N ₉₎ -3 '

Primer B 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3 '

1. Extracción del ácido nucleico

1. La extracción de ácidos nucleicos a partir de muestras clínicas se deben realizar en el Nivel de Bioseguridad 2 (BSL-2) o más condiciones, ya que estas muestras son potencialmente infecciosas.
2. La muestra de exudado nasal se transporta en medio de retención viral. Alícuota de 200 l de la muestra en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml Eppendorf.
3. Opcional: pasar de la muestra a través de un filtro de 0,22 micras (para purificar las partículas virales)
4. Opcional: muestra pretratamiento con DNasa (que degradan el ADN genómico de acogida, y limpiarnos de protección, encapsulados ácido nucleico viral) utilizando el kit de Turbo DNAsa (Ambion) por las instrucciones del fabricante
5. Extracto de la muestra utilizando el Zymo ZR ARN viral kit de extracción o Qiagen Kit Virus Ultrasens según las instrucciones del fabricante.

2. Transcripción reversa y 2 ^º capítulo de la síntesis de ADNc ("Ronda A")

1. Añadir un uL 40 pmol / l Primer A 4 uL ARN extraído. Calor a 65 ° C durante 5 minutos en un termociclador (por ejemplo, GeneAmp PCR System 9700) y luego dejar enfriar a temperatura ambiente x 5 min.
2. Añadir 5 l de una mezcla maestra que consta de 2 l de 5X buffer RT, 1 l 12,5 mM dNTP, 1 l de agua, 0,5 l 0,1 M TDT, y un 0,5 l RT SSIII (Invitrogen). Se incuba a 42 ° C x 60 minutos.
3. En un termociclador programable, el calor a 94 ° C x 2 min (para abortar la reacción de la transcriptasa inversa), se enfría a 10 ° C, se centrifuga el pulso, y luego añadir 5 Sequenase l mezcla que consiste en un búfer de l Sequenase 5X, 3,8 l de agua, y 0,15 l Sequenase (USB Corporation). Para 2 ^º capítulo de síntesis, la rampa encima de 10 ° C a 37 ° C durante 8 min, mantener 8 minutos, luego caliente a 94 ° C x 2 min (para inactivar Sequenase) y se enfría a 10 ° C (espera).
4. Opcional: Rd Una muestra de cDNA se pueden almacenar en este punto a -20 ° C.

3. La amplificación por PCR del ADNc azar Preparado ("Ronda B")

1. Añadir 5 uL de Rd una muestra de 45 l de una mezcla maestra que consta de 5 l buffer 10X PCR, 1 l 12,5 mM dNTP, 1 l 100 pmol / l B imprimación, 1 l LA KlenTaq (Sigma), y 37 l de agua.
2. Ejecutar protocolo de PCR de la siguiente manera: 94 ° C, 2 min → (25 ciclos de 94 ° C, 30 s / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 min) → 72 ° C, 5 min → 10 ° C ( espera)
3. Compruebe la muestra Rd B en un gel de electroforesis de agarosa al 1,5%. Una prueba de aproximadamente 200 - 1000 pb debe ser visualizado (Figura 2A)

4. Incorporación Cy3 tinte fluorescente

1. Opcional: otra muestra se pueden etiquetar con el colorante fluorescente Cy5 y hibridizada a los microarrays mismo.
2. Para incorporar aa-dNTP, añadir 5 uL de la muestra B Rd a 45 l de una mezcla maestra que consta de 5 uL buffer 10X PCR, 1 uL 12,5 mm AA-dNTP (Invitrogen), 1 uL 100 pmol / uL cartilla B, 1, 1 uL KlenTaq LA (Sigma), y 37 uL de agua. Ejecutar protocolo de PCR de la siguiente manera: 94 ° C, 2 min → (15 ciclos de 94 ° C, 30 s / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 min) → 72 ° C, 5 min → 10 ° C ( espera)
3. Limpiar la muestra Rd C con el ADN limpio y Concentrador-5 Kit (Zymo de Investigación) por las instrucciones del fabricante. Eluyen en 10 mL.
4. Añadir 1 l de bicarbonato 1M (Sigma) y 1 uL Cy5 (GE Healthcare) a la muestra C Rd.
5. Incubar x 1 hora en la oscuridad.
6. Limpiar la muestra Cy3 marcado con el ADN limpio y Concentrador-5 Kit (Zymo de Investigación) por las instrucciones del fabricante. Eluyen en 12 mL.

5. La hibridación de microarrays Virochip

1. Opcional: use 1.5 l para comprobar la concentración de cDNA y la cantidad de colorante incorporado en un espectrofotómetro Nanodrop (para la normalización de las muestras)
2. En un tubo de strip PCR añadir un buffer l fragmentación 25X, 5 l 5X buffer de bloqueo, 9,5 l (o la cantidad de normalizar) de Cy3 marcado de la muestra, y el agua hasta un volumen total de 25 l (Agilent)
3. Añadir 25 l de tampón de hibridación 2X Gex (Agilent). Centrifugar brevemente para eliminar las burbujas.
4. Carga de 40 l de la muestra de diapositivas en la junta.
5. Lugar Agilent impreso Virochip array (Universidad de Californiuna, San Francisco / Agilent) (lado marcado "Agilent" hacia abajo) en la parte superior de la diapositiva junta y apretar el tornillo con firmeza.
6. Hibridación noche a la mañana en el horno 65 ° C, ajuste de velocidad a 10 rpm.
7. Para lavar las matrices, precalentar el buffer 2 (Agilent) a 37 ° C. Desmontar la junta de diapositivas / array submarino sándwich en un buffer (Agilent). Lave en tampón 1 x 1 min. Lave en tampón precalentado 2 x 1 min. Poco a poco eliminar diapositivas de tampón 2, teniendo cuidado de evitar las burbujas (uso Kimwipe para absorber la humedad adicional, teniendo cuidado de evitar el contacto directo con el lado activo de la matriz)
8. Lugar de diapositivas en el soporte de diapositivas e insertar en el escáner matriz.

6. Virochip exploración y análisis

1. Exploración Cy3 marcado matriz en 5 micras o 2 micras según el protocolo del instrumento de exploración estándar (Figura 2B).
2. Analizar microarrays Virochip por inspección visual, análisis de cluster, o el programa automatizado Virochip análisis, E-Predecir ^11. Por cada uno de estos tres métodos, el virus de la influenza se detecta fácilmente en la muestra de exudado nasal (de un niño con enfermedad tipo influenza) (Figura 2 C)

7. Los resultados representativos:

Cuando el protocolo se hace correctamente, una prueba debe ser visto en la electroforesis en gel de agarosa después del paso de Rd B (Figura 2). Los microarrays Virochip en la plataforma de Agilent será difícil de analizar visualmente (Figura 2B), pero si hay un virus que debe ser fácilmente identificados por inspección visual, análisis de conglomerados, y / o E-Predecir (fig. 1C). Las muestras pueden ser enriquecida con las cantidades medidas de ácido nucleico de un virus (virus del mosaico del tabaco; bacteriófago MS2) para servir como un control positivo para el ensayo.

Figura 1. Esquemática de Virochip procesamiento y análisis de microarrays. Extraído de ácidos nucleicos a partir de muestras clínicas son amplificado al azar, etiquetados con tintes fluorescentes, y hibridizada a los microarrays Virochip. Microarrays se escanean a una resolución de 2 micras y se analizaron mediante una variedad de herramientas computacionales, incluyendo E-Predecir.

Figura 2. Pasos en el ensayo de Virochip Después de la amplificación por PCR al azar, una mancha de 200 -. 1.000 pares de bases puede ser visualizado por electroforesis en gel (A) (B) Tres microarrays Virochip de los 8 conjuntos / portaobjetos de vidrio se muestran, con una pequeña región. de un microarray de soplado en el recuadro en la esquina inferior derecha. (C) automatizado de análisis de microarrays viral mediante E-Predecir revelando la presencia de virus de influenza A en la muestra clínica. La puntuación alta similitud (s = 0,55) corresponde a un p-valor que se aproxima a cero, lo que hace esta una predicción muy importante.

Discusión

El protocolo Virochip como se describe aquí es complejo y requiere un técnico de investigación meticulosa y especializada. La concentración correcta de los reactivos y las condiciones de PCR, el etiquetado y la hibridación son críticos. El protocolo Virochip se puede modificar fácilmente para adaptarse a un análisis de los tejidos enfermos mediante el uso de un método de extracción de tejidos, tales como TRIzol (Invitrogen) para la extracción de ácidos nucleicos. Las sondas se pueden añadir o eliminar si es necesario para obtener el espectro deseado y amplitud de la cobertura, por ejemplo, las sondas de detección de blancos no virales tales como bacterias y hongos pueden ser diseñados y agregó que "en la marcha". Algunas aplicaciones de la prueba Virochip actualmente en desarrollo incluyen un amplio espectro de diagnóstico viral en el laboratorio clínico, investigación de brotes, detección pureza de las drogas y vacunas, y el descubrimiento de nuevos patógenos virales.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo / material	Nombre del reactivo / material
Primera	5'-GTTTCCCAGTCACGATA (N9) -3 '
Primer B	5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3 '
RT Master Mix (5 l)	2 l de 5X buffer RT
	1 l 12,5 mM dNTP (Invitrogen)
	1 l de agua
	0,5 l 0,1 M TDT
	0,5 l RT SSIII (Invitrogen)
Sequenase Mix (5 l)	Un buffer l Sequenase 5X
	3,8 l de agua
	0,15 l Sequenase (USB Corporation)
ª B PCR Master Mix (45 l)	5 l buffer 10X PCR
	1 l 12,5 mM dNTP (Invitrogen)
	1 l 100 pmol / l cartilla B
	1 l LA KlenTaq (Sigma)
	37 l de agua
º C PCR Master Mix (45 l)	Buffer 5 uL 10X PCR
	1 l 12,5 mM dNTP (Invitrogen)
	1 l 100 pmol / l cartilla B
	1 l LA KlenTaq (Sigma)
	37 l de agua
La hibridación de amortiguación (25 l)	Un buffer l fragmentación 25X (Agilent)
	5 l 5X buffer de bloqueo (Agilent)
	9,5 l (o la cantidad de normalizar) de Cy3 marcado de la muestra
	Agregar agua a volumen total de 25 l
Agilent Virochip microarrays	permiso en espera, disponible a partir de Chiu laboratorio, UCSF