באמצעות assay הפאן ויראלי microarray (Virochip) אל מסך דוגמאות קליניות עבור פתוגנים ויראליים

Summary

Virochip הוא microarray הפאן ויראלי שנועד לזהות בו זמנית את כל וירוסים ידועים, כמו גם וירוסים רומן על בסיס הומולוגיה ברצף נשמרת. כאן אנו מדגימים איך לנהל assay Virochip לנתח דגימות קליניות עבור נוכחות של וירוסים מוכרים ושאינם מוכרים.

Abstract

האבחנה של גורם נגיפי מחלות זיהומיות רבות קשה בשל המגוון רצף הטבועה של וירוסים, כמו גם את הופעתם המתמשכת של פתוגנים נגיפיים הרומן, כמו הסארס קורונה ו - 2009 מגיפת נגיף שפעת H1N1, אשר אינו יכול לאתר את השיטות המסורתיות. כדי לטפל באתגרים אלה, פיתחנו בעבר ומאומתים פלטפורמה הפאן ויראלי microarray שנקרא Virochip עם היכולת לזהות את כל וירוסים ידועים, כמו גם גרסאות רומן על בסיס הומולוגיה ברצף משומר ^1. שימוש Virochip, זיהינו את מלוא הספקטרום של וירוסים הקשורים זיהומים בדרכי הנשימה, כולל מקרים של מחלה קריטית מוסברת בחולים מאושפזים, עם רגישות שווה או עולה על ^2-5 קונבנציונאלי ניסויים קליניים. Virochip שימש גם כדי לזהות וירוסים רומן, כולל קורונה הסארס ^6,7, clade rhinovirus הרומן ^5, XMRV (רטרווירוס קשור לסרטן הערמונית) ^8, bornavirus העופות (הגורם ממחלה ממארת ב תוכים) ^9, ו cardiovirus רומן בילדים עם מחלה נשימתית שלשולים ^10. הגרסה הנוכחית של Virochip כבר ported כדי פלטפורמת Agilent microarray והוא מורכב ~ 36,000 בדיקות נגזר על ~ 1500 וירוסים GenBank בדצמבר 2009. כאן אנו מדגימים את השלבים המעורבים בעיבוד assay Virochip מתחילתו ועד סופו (~ זמן אספקה ​​24 שעות), כולל מיצוי מדגם חומצת גרעין, הגברה PCR בעזרת פריימרים אקראיים, שילוב צבע פלואורסצנטי, ואת ההכלאה microarray, סריקה וניתוח.

Protocol

השלבים של assay Virochip כוללים (1) מיצוי חומצות גרעין מ דגימות קליניות, (2) שעתוק לאחור של רנ"א לחלץ 2 ^nd-גדיל סינתזה cDNA, (3) הגברה של cDNA PCR ערוכה באופן אקראי, (3) Cy3 שילוב צבע פלואורסצנטי , (4) הכלאה של חומר הנקרא על microarray Virochip, ו (5) סריקה וניתוח (איור 1). פרוטוקול להלן תדגים את השימוש של assay Virochip על מדגם האף ספוגית מילד עם מחלה דמוית שפעת.

פריימר רצפים

פריימר 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-(N ₉₎ -3 "

פריימר ב 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3 "

1. חומצות גרעין Extraction

1. מיצוי חומצות גרעין מ דגימות קליניות צריכה להתבצע תחת רמה biosafety 2 (BSL-2) או תנאים גבוהים יותר, כמו דגימות אלה זיהומיות פוטנציאלי.
2. המדגם ספוגית האף מועבר בינוני מחזיק ויראלי. 200 Aliquot μL המדגם לתוך צינור 1.5 microcentrifuge Eppendorf מ"ל.
3. אופציונלי: לעבור דרך פילטר מדגם 0.22 מיקרומטר (לטהר עבור חלקיקים נגיפיים)
4. אופציונלי: מדגם pretreat עם DNAse (לבזות DNA הגנומי מארח ולטהר עבור חומצה מוגן encapsidated, גרעין ויראלית) באמצעות טורבו DNAse Kit (Ambion) לפי הוראות היצרן
5. חלץ את המדגם באמצעות ZR Zymo נגיפי RNA ערכת חילוץ או Qiagen ערכת Ultrasens וירוס לכל הוראות היצרן.

2. שעתוק לאחור ו 2 ^nd-גדיל סינתזה cDNA ("סיבוב")

1. הוסף 1 UL 40 pmol / μL פריימר על UL 4 חילוץ RNA. מחממים עד 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות בתוך thermocycler (למשל GeneAmp PCR System 9700) ולאחר מכן אפשר לצנן את טמפ 'החדר 5 דקות x.
2. הוסף 5 μL תמהיל מאסטר המורכב של 2 חיץ μL RT 5X, 1 μL 12.5 mM dNTP, 1 מים μL, 0.5 μL 0.1M DTT, ו 0.5 μL SSIII RT (Invitrogen). לדגור על 42 ° C x 60 דקות.
3. ב thermocycler לתכנות, חום 94 מעלות צלזיוס x 2 דקות (כדי להפיל את התגובה transcriptase הפוכה), קריר עד 10 ° C, צנטריפוגה הדופק, ולאחר מכן להוסיף 5 לערבב Sequenase μL המורכב חיץ Sequenase μL 1 5X, 3.8 מים μL, ו 0.15 Sequenase μL (USB Corporation). לסינתזה גדיל 2 ^nd, כבש למעלה מ 10 ° C עד 37 ° C במשך 8 דקות, להחזיק 8 דקות, אז חום 94 מעלות צלזיוס x 2 דקות (כדי להשבית Sequenase) ומצננים עד 10 ° C (להחזיק).
4. אופציונלי: Rd מדגם cDNA יכול להיות מאוחסן בשלב זה ב -20 ° C.

3. PCR הגברה של cDNA שהוכשרנו אקראי ("Round B")

1. הוסף 5 UL של Rd מדגם μL 45 תמהיל מאסטר המורכב 5 חיץ μL PCR 10X, 1 μL 12.5 mM dNTP, 1 μL 100 pmol / μL B פריימר, 1 μL KlenTaq אנג'לס (Sigma), ו 37 מים μL.
2. הפעל PCR פרוטוקול כדלקמן: 94 ° C, 2 דקות → (25 מחזורים של 94 ° C, 30 s / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 דקות) → 72 ° C, 5 דקות → 10 ° C ( להחזיק)
3. בדיקת מדגם B Rd על ג'ל אלקטרופורזה agarose 1.5%. למרוח מכ 200 - 1000 bp צריך להיות דמיינו (איור 2 א)

4. Cy3 צבע פלואורסצנטי התאגדות

1. אופציונלי: דוגמה נוספת יכולה להיות מתויג עם צבע Cy5 פלורסנט הכלאה כדי microarray זהה.
2. כדי לשלב aa-dNTP, להוסיף 5 UL מדגם B Rd ל UL 45 תמהיל מאסטר המורכב 5 חיץ UL PCR 10X, 1 ul 12.5 aa-dNTP (Invitrogen) מ"מ, 1 UL 100 pmol / ul תחל ב ', 1, 1 UL KlenTaq אנג'לס (Sigma), ו 37 מים UL. הפעל PCR פרוטוקול כדלקמן: 94 ° C, 2 דקות → (15 מחזורים של 94 ° C, 30 s / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 דקות) → 72 ° C, 5 דקות → 10 ° C ( להחזיק)
3. נקו את מדגם C Rd עם ה-DNA נקי מרוכז-5 Kit (Zymo המחקר) לפי הוראות היצרן. Elute ב μL 10.
4. הוסף 1 UL של ביקרבונט 1M (Sigma) ו 1 UL Cy5 (GE Healthcare) מדגם C Rd.
5. דגירה x 1 שעה בחושך.
6. נקו את המדגם Cy3 שכותרתו עם ה-DNA נקי מרוכז-5 Kit (Zymo המחקר) לפי הוראות היצרן. Elute ב μL 12.

5. הכלאה כדי Virochip microarray

1. אופציונלי: שימוש 1.5 μL כדי לבדוק ריכוז cDNA ואת כמות הצבע שולב ב ספקטרופוטומטר Nanodrop (לנורמליזציה של דגימות)
2. בתוך צינור רצועה PCR להוסיף 1 הפיצול μL חיץ 25X, 5 μL חיץ חסימת 5X, 9.5 μL (או כמות לנרמל) של מדגם Cy3 שכותרתו, ומים בהיקף כולל של μL 25 (Agilent)
3. הוסף 25 μL של חיץ GEX 2X הכלאה (Agilent). ספין למטה בקצרה כדי להסיר בועות.
4. טען 40 μL המדגם לשקופית אטם.
5. המקום Agilent מודפס מערך Virochip (אוניברסיטת Californi, סן פרנסיסקו / Agilent) (הצד המסומן "Agilent" למטה) על גבי השקופית אטם ולהדק את הבורג בחוזקה.
6. להכליא בין לילה ב 65 מעלות צלזיוס בתנור, הגדרת מהירות של 10 סל"ד.
7. כדי לשטוף מערכים, מחממים חוצץ 2 (Agilent) עד 37 ° C. לפרק שקופיות / מערך אטם תת כריך במאגר 1 (Agilent). לשטוף במאגר 1 x 1 דקות. לשטוף במאגר שחומם מראש 2 x 1 דקות. לאט לאט להסיר שקופיות חוצץ 2, להיות זהיר, כדי למנוע בועות (שימוש kimwipe אל הפתיל משם לחות נוספת להיות זהיר, כדי למנוע מגע ישיר הצד הפעיל של המערך)
8. מקום להחליק לתוך מחזיק שקופיות להכניס לתוך מערך סורק.

6. Virochip סריקה וניתוח

1. סריקה Cy3 שכותרתו מערך בשעה 5 מיקרומטר או 2 מיקרומטר על פי פרוטוקול סריקה רגילה של המכשיר (איור 2B).
2. ניתוח microarrays Virochip על ידי בדיקה חזותית, ניתוח אשכולות, או תוכנית ניתוח אוטומטי Virochip, ^E-11 לחזות. על ידי כל אחד מהם שלוש שיטות, נגיף השפעת זוהה בקלות במדגם האף ספוגית (מילד עם מחלה דמוית שפעת) (איור 2C)

7. נציג תוצאות:

כאשר הפרוטוקול הוא נעשה בצורה נכונה, משטח יש לראות על ג'ל אלקטרופורזה agarose לאחר השלב Rd B (איור 2 א). Microarray Virochip על פלטפורמת Agilent יהיה קשה לנתח חזותית (תרשים 2B), אבל אם קיים וירוס זה צריך להיות מזוהה בקלות על ידי בדיקה חזותית, ניתוח אשכולות, ו / או E-לחזות (תרשים 1C). דוגמאות ניתן מתובל בכמות מדודה של חומצות גרעין של נגיף הידוע (וירוס למשל פסיפס טבק; MS2 bacteriophage) לשמש כביקורת חיובית עבור assay.

באיור 1. סכמטי של עיבוד microarray Virochip וניתוח. חולץ חומצות גרעין מ דגימות קליניות הם מוגבר באופן אקראי, שכותרתו עם צבעי ניאון, ו הכלאה של microarray Virochip. Microarrays נסרקים ברזולוציה 2 מיקרומטר ונותחו באמצעות מגוון של כלים חישוביים, כולל דואר לחזות.

איור 2. שלבים assay Virochip לאחר הגברה על ידי אקראי PCR, כתם של 200 -. 1000 bp ניתן דמיינו ידי ג'ל אלקטרופורזה (א) (ב) שלושה microarrays Virochip מתוך 8 מערכים / שקופיות זכוכית מוצגים, עם אזור קטן. microarray של one מוגדל של הבלעה על בפינה הימנית התחתונה. (ג) ניתוח אוטומטי microarray ויראלי באמצעות דואר לחזות חושף את נוכחותו של וירוס שפעת במדגם קליניים. הציון דמיון גבוה (s = 0.55) מקבילה לערך-p כי הוא קרוב לאפס, ובכך זה ניבוי משמעותי ביותר.

Discussion

פרוטוקול Virochip כפי שתואר כאן הוא מורכב ודורש טכנאי מחקר קפדני ומיומן. ריכוזים מגיב נכון ותנאים PCR, תיוג, הכלאה הם קריטיים. פרוטוקול Virochip ניתן לשנות בקלות כדי להתאים ניתוח לרקמות החולות על ידי השימוש בשיטה רקמה מיצוי כגון TRIzol (Invitrogen) להפקת חומצות גרעין. בדיקות ניתן להוסיף או נמחקו כנדרש בכדי להשיג את הספקטרום הרצוי ולרוחבה של הסיקור, למשל, בדיקות לגילוי מטרות nonviral כגון חיידקים ופטריות יכול להיות מתוכנן, והוסיף "ב-the-fly". יישומים מסוימים של assay Virochip בשלבי פיתוח כוללים קשת רחבה אבחון ויראלי במעבדה קלינית, חקירה פרוץ, הקרנת טוהר של תרופות וחיסונים, גילוי נגיפי רומן הפתוגן.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב / חומר	שם מגיב / חומר
Primera	5'-GTTTCCCAGTCACGATA-(N9) -3 "
פריימר B	5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3 "
RT מאסטר מיקס (5 μL)	2 μL חיץ 5X RT
	1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen)
	1 μL מים
	0.5 μL 0.1M DTT
	0.5 μL SSIII RT (Invitrogen)
Sequenase מערבבים (5 μL)	1 μL Sequenase 5X חיץ
	3.8 μL מים
	0.15 Sequenase μL (USB Corporation)
Rd B PCR מאסטר מיקס (45 μL)	5 μL חיץ 10X-PCR
	1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen)
	1 μL 100 pmol / μL תחל ב
	1 μL KlenTaq אנג'לס (Sigma)
	37 μL מים
Rd C PCR מאסטר מיקס (45 μL)	5 UL חיץ 10X-PCR
	1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen)
	1 μL 100 pmol / μL תחל ב
	1 μL KlenTaq אנג'לס (Sigma)
	37 μL מים
הכלאה חיץ (25 μL)	1 חיץ μL הפיצול 25X (Agilent)
	5 μL חיץ חסימת 5X (Agilent)
	9.5 μL (או כמות לנרמל) של מדגם Cy3 שכותרתו
	מוסיפים מים עד נפח כולל של 25 μL
Agilent Virochip microarray	זמין מ - צ'יו מעבדה, קליפורניה בסן פרנסיסקו; ממתינים רישיון