En utilisant un dosage Microarray pan-virale (Virochip) pour cribler des échantillons cliniques pour les pathogènes viraux

Résumé

Le Virochip est une puce pan-viral conçu pour détecter simultanément tous les virus connus ainsi que de nouveaux virus sur la base d'une homologie de séquence conservée. Ici, nous montrent comment exécuter un test Virochip pour analyser des échantillons cliniques pour la présence de virus connus et inconnus.

Résumé

Le diagnostic des causes virales de nombreuses maladies infectieuses est difficile en raison de la diversité des séquences inhérentes de virus ainsi que l'émergence continue de nouveaux agents pathogènes viraux, tels que le coronavirus du SRAS et de grippe pandémique H1N1 2009 virus, qui ne sont pas détectables par les méthodes traditionnelles. Pour relever ces défis, nous avons précédemment développé et validé une plateforme biopuces pan-virale appelée Virochip avec la capacité de détecter tous les virus connus ainsi que de nouveaux variants sur la base d'une homologie de séquence conservée ^1. Utilisation de la Virochip, nous avons identifié le spectre complet des virus associés à des infections respiratoires, y compris des cas de maladie grave inexpliquée chez les patients hospitalisés, avec une sensibilité équivalente ou supérieure à ^2-5 tests cliniques classiques. Le Virochip a également été utilisé pour identifier de nouveaux virus, y compris le coronavirus du SRAS ^6,7, un clade rhinovirus roman ^5, XMRV (un rétrovirus liés à la prostate) ^8, bornavirus aviaire (la cause d'une maladie débilitante chez les perroquets) ^9, et un roman dans cardiovirus enfants souffrant de maladies respiratoires et diarrhéiques ^10. La version actuelle de la Virochip a été porté à une plateforme Agilent microarray et se compose de 36 000 ~ sondes issues de plus de 1500 ~ virus dans GenBank à partir de Décembre 2009. Nous montrerons les étapes impliquées dans le traitement d'un test Virochip du début à la fin (temps ~ retournement 24 heures), y compris l'extraction des acides nucléiques de l'échantillon, l'amplification par PCR utilisant des amorces aléatoires, l'incorporation de colorants fluorescents, et l'hybridation biopuces, de numérisation et d'analyse.

Protocole

Les étapes de l'essai Virochip incluent (1) l'extraction des acides nucléiques à partir d'échantillons cliniques, (2) la transcription inverse de l'ARN extrait et 2 ^ème brin synthèse de l'ADNc, (3) L'amplification par PCR de l'ADNc amorcés au hasard, (3) l'incorporation colorant fluorescent Cy3 , (4) l'hybridation des matériaux étiquetés pour la puce Virochip, et (5) la numérisation et l'analyse (figure 1). Le protocole présenté ci-dessous montrent l'utilisation de l'essai sur un échantillon Virochip écouvillon nasal d'un enfant avec un syndrome grippal.

Séquences des amorces

Amorce A 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-(N ₉₎ -3 '

Primer B 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3 '

1. Extraction des acides nucléiques

1. Extraction des acides nucléiques à partir d'échantillons cliniques doivent être effectuées sous le niveau de biosécurité 2 (BSL-2) ou plus des conditions, comme ces échantillons sont potentiellement infectieux.
2. L'échantillon écouvillon nasal est transporté dans un milieu de détention virale. Partie aliquote de 200 ul de l'échantillon dans un tube de 1,5 ml Eppendorf.
3. En option: passage de l'échantillon à travers un filtre de 0,22 um (pour purifier des particules virales)
4. En option: l'échantillon prétraiter à la DNAse (pour dégrader l'ADN génomique d'hôte et de purifier pour les aires protégées, de l'acide nucléique viral encapsidé) en utilisant le kit turbo DNAse (Ambion) par les instructions du fabricant
5. Extraire l'échantillon en utilisant l'ARN viral Zymo ZR Extraction Kit ou Kit Qiagen Virus Ultrasens selon les instructions du fabricant.

2. Transcription inverse et 2 ^ème brin synthèse de l'ADNc («Round A»)

1. Ajouter 1 UL 40 pmol / uL Primer A à 4 pl extrait l'ARN. Chauffer à 65 ° C pendant 5 min dans un thermocycleur (par exemple GeneAmp PCR System 9700), puis laisser refroidir à température ambiante température x 5 min.
2. Ajouter 5 ul d'un mélange maître comprenant 2 uL de tampon RT 5X, 1 pi 12,5 mM dNTP, 1 uL d'eau, 0,5 pi DTT 0,1 M et 0,5 uL SSIII RT (Invitrogen). Incuber à 42 ° C x 60 minutes.
3. Dans un thermocycleur programmable, de la chaleur à 94 ° C x 2 minutes (pour annuler la réaction de la transcriptase inverse), laisser refroidir à 10 ° C, centrifuger le pouls, puis ajouter 5 mélangez Sequenase uL composé d'une mémoire tampon Sequenase uL 5X, 3,8 pi d'eau, et 0,15 uL Sequenase (USB Corporation). Pour 2 ^ème synthèse des brins, montée en puissance de 10 ° C à 37 ° C en 8 min, tenir 8 min, puis chauffer à 94 ° C x 2 minutes (pour inactiver Sequenase) et laisser refroidir à 10 ° C (en attente).
4. En option: Rd Un échantillon d'ADNc peut être conservé à ce point à -20 ° C.

3. Amplification par PCR de hasard apprêté ADNc («Ronde B")

1. Ajouter 5 uL de Rd Un échantillon de 45 ul d'un mélange maître constitué de 5 tampon PCR 10X uL, 1 pi 12,5 mM dNTP, 1 ul amorce B 100 pmol / ul, 1 ul Klentaq LA (Sigma), et 37 pi d'eau.
2. Exécuter protocole de PCR comme suit: 94 ° C, 2 min → (25 cycles de 94 ° C, 30 s / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 mn) → 72 ° C, 5 min → 10 ° C ( attente)
3. Vérifier l'échantillon B Rd sur un gel d'électrophorèse d'agarose 1,5%. Un frottis d'environ 200 - 1000 pb devrait être visualisées (figure 2A)

4. Cy3 Incorporation colorant fluorescent

1. En option: un autre échantillon peut être étiqueté avec le colorant fluorescent et Cy5 hybride à la puce même.
2. Pour intégrer aa-dNTP, ajouter 5 uL de Rd échantillon B à 45 uL d'un master mix composé de 5 tampon PCR 10X uL, 1 uL 12,5 mm AA-dNTP (Invitrogen), 1 uL 100 apprêt pmol / ul B, 1, 1 uL Klentaq LA (Sigma), et 37 d'eau ul. Exécuter protocole de PCR comme suit: 94 ° C, 2 min → (15 cycles de 94 ° C, 30 s / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 mn) → 72 ° C, 5 min → 10 ° C ( attente)
3. Nettoyer l'échantillon Rd C avec l'ADN propre et Concentrateur-5 Kit (Zymo Research) par les instructions du fabricant. Eluer dans 10 ul.
4. Ajouter 1 uL de bicarbonate de 1M (Sigma) et 1 ul Cy5 (GE Healthcare) à l'échantillon Rd C.
5. Incuber x 1 heure dans l'obscurité.
6. Nettoyer l'échantillon Cy3-étiquetés avec l'ADN propre et Concentrateur-5 Kit (Zymo Research) par les instructions du fabricant. Eluer dans 12 uL.

5. Hybridation d'Virochip Microarray

1. En option: utiliser 1,5 uL de vérifier la concentration d'ADNc et la quantité de colorant incorporé sur un spectrophotomètre Nanodrop (pour la normalisation des échantillons)
2. Dans un tube de la bande de PCR ajouter 1 pi de tampon de fragmentation 25X, 5 pl de tampon 5X blocage, 9,5 ul (ou le montant de normaliser) de Cy3-étiquetés de l'échantillon, et l'eau pour un volume total de 25 uL (Agilent)
3. Ajouter 25 uL de tampon d'hybridation 2X Gex (Agilent). Centrifuger brièvement pour éliminer les bulles.
4. Charge à 40 uL de l'échantillon sur la glissière du joint.
5. Placez-imprimés Agilent array Virochip (Université de Californiune, San Francisco / Agilent) (côté marqué "Agilent" vers le bas) sur le dessus de la glissière joint et fixez la vis serrée.
6. Hybrider nuit dans le four à 65 ° C, réglage de la vitesse à 10 tpm.
7. Pour laver les tableaux, préchauffer le tampon de 2 (Agilent) à 37 ° C. Prenez part sous joint sandwichs glisser / tableau dans un tampon de 1 (Agilent). Laver dans le tampon de 1 x 1 min. Laver dans le tampon préchauffé 2 x 1 min. Retirer lentement glisser du tampon 2, en prenant soin d'éviter les bulles (utilisation Kimwipe pour évacuer l'humidité supplémentaire en prenant soin d'éviter de toucher directement l'aspect actif de la matrice)
8. Placez diapositives dans le support de diapositives et insérer dans scanneur tableau.

6. Virochip balayage et d'analyse

1. Balayage Cy3 étiquetés tableau à 5 um um ou 2 selon le protocole de l'instrument de balayage standard (figure 2B).
2. Analyser microarrays Virochip par inspection visuelle, l'analyse typologique, ou le programme d'analyse automatisée Virochip, E-Predict ^11. En chacun de ces trois méthodes, le virus de l'influenza est facilement détectée dans l'échantillon écouvillon nasal (à partir d'un enfant avec syndrome grippal) (figure 2C)

7. Les résultats représentatifs:

Lorsque le protocole est fait correctement, un frottis devraient être visibles sur l'électrophorèse sur gel d'agarose après l'étape Rd B (figure 2A). Les biopuces Virochip sur la plateforme Agilent sera difficile d'analyser visuellement (figure 2B), mais si un virus est présent, il devrait être facilement identifiés par l'inspection visuelle, l'analyse typologique, et / ou E-Predict (figure 1C). Les échantillons peuvent être dopés avec des quantités mesurées de l'acide nucléique d'un virus connu (par exemple le virus de la mosaïque du tabac; bactériophage MS2) pour servir de contrôle positif pour le dosage.

Figure 1. Schéma des biopuces Virochip traitement et d'analyse. Extraite d'acides nucléiques à partir d'échantillons cliniques sont amplifiés au hasard, marqués avec des colorants fluorescents, et hybridées à la puce Virochip. Microarrays sont numérisées à une résolution de 2 um et analysées en utilisant une variété d'outils informatiques, y compris E-Predict.

Figure 2. Étapes dans le dosage de Virochip Après amplification par PCR aléatoire, un frottis de 200 -. 1000 pb peut être visualisé par électrophorèse sur gel (A) (B) Trois puces Virochip sur les 8 tableaux / lame de verre sont présentés, avec une petite région. d'une biopuce soufflé dans l'encart dans le coin inférieur droit. (C) automatisé biopuces d'analyse virale en utilisant E-Predict révélant la présence de virus influenza A dans l'échantillon clinique. Le score de similarité élevé (s = 0,55) correspond à une p-valeur qui est proche de zéro, ce qui rend cette une prédiction extrêmement important.

Discussion

Le protocole Virochip comme décrit ici est complexe et nécessite un technicien de recherche minutieux et compétent. Concentrations de réactifs et des conditions correctes pour la PCR, l'étiquetage, et l'hybridation sont critiques. Le protocole Virochip peut être facilement modifié pour accueillir l'analyse des tissus malades par l'utilisation d'une méthode d'extraction des tissus tels que Trizol (Invitrogen) pour l'extraction des acides nucléiques. Les sondes peuvent être ajoutées ou supprimées au besoin d'obtenir le spectre désiré et l'étendue de la couverture, par exemple, des sondes pour la détection de cibles non viraux tels que les bactéries et les champignons peuvent être conçus et ajouté «à la volée". Certaines applications de l'analyse Virochip actuellement en développement comprennent large spectre diagnostic des maladies virales dans les laboratoires cliniques, l'investigation des flambées, le dépistage pureté des médicaments et des vaccins, et la découverte de nouveaux agents pathogènes viraux.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom de réactif / matériel	Nom de réactif / matériel
Primera	5'-GTTTCCCAGTCACGATA-(N9) -3 '
Primer B	5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3 '
RT Mix Master (5 uL)	2 ul de tampon 5X RT
	1 ul 12,5 mM dNTP (Invitrogen)
	1 uL d'eau
	0,5 ul DTT 0,1 M
	0,5 ul SSIII RT (Invitrogen)
Sequenase Mix (5 uL)	1 pl de tampon 5X Sequenase
	3,8 uL d'eau
	0,15 uL Sequenase (USB Corporation)
Rd B PCR Master Mix (45 ul)	5 ul de tampon 10X PCR
	1 ul 12,5 mM dNTP (Invitrogen)
	1 ul 100 amorce B pmol / uL
	1 ul Klentaq LA (Sigma)
	37 uL d'eau
Rd C PCR Master Mix (45 ul)	5 uL de tampon 10X PCR
	1 ul 12,5 mM dNTP (Invitrogen)
	1 ul 100 amorce B pmol / uL
	1 ul Klentaq LA (Sigma)
	37 uL d'eau
Tampon d'hybridation (25 ul)	1 pi de tampon de fragmentation 25X (Agilent)
	5 ul de tampon 5X blocage (Agilent)
	9,5 ul (ou le montant de normaliser) de Cy3-étiquetés de l'échantillon
	Ajouter de l'eau au volume total de 25 uL
Agilent Virochip biopuces	licence en attendant, disponible à Chiu laboratoire, UCSF