Utilizzando un pan-virale Assay Microarray (Virochip) allo schermo campioni clinici di patogeni virali

Riepilogo

Il Virochip è un pan-virale microarray progettati per rilevare contemporaneamente tutti i virus conosciuti e nuovi virus sulla base di omologia di sequenza conservati. Qui mostriamo come eseguire un test Virochip per analizzare i campioni clinici per la presenza di virus noti e sconosciuti.

Abstract

La diagnosi di cause virali di molte malattie infettive è difficile a causa della intrinseca diversità sequenza di virus così come l'emergere continuo di nuovi agenti patogeni virali, come la SARS coronavirus e il 2009 pandemia di H1N1 virus dell'influenza, che non sono rilevabili con i metodi tradizionali. Per affrontare queste sfide, abbiamo precedentemente sviluppato e validato un pan-virale piattaforma microarray chiamato Virochip con la capacità di rilevare tutti i virus conosciuti così come le varianti romanzo sulla base di omologia di sequenza conservati ^1. Utilizzando il Virochip, abbiamo identificato l'intero spettro dei virus associati con infezioni respiratorie, compresi i casi di inspiegabili malattia critica nei pazienti ospedalizzati, con una sensibilità pari o superiore a ^05/02 convenzionali test clinici. Il Virochip è stato utilizzato anche per identificare nuovi virus, tra cui il coronavirus della SARS ^6,7, un clade rinovirus romanzo ^5, XMRV (un retrovirus collegato al cancro della prostata) ^8, bornavirus aviaria (la causa di una malattia devastante in pappagalli) ^9, e un cardiovirus romanzo in bambini con malattie respiratorie e diarrea ^10. La versione attuale del Virochip è stato portato su una piattaforma microarray Agilent ed è costituito da ~ 36.000 sonde derivanti da più di ~ 1.500 virus in GenBank a partire dal dicembre del 2009. Qui mostriamo i passaggi necessari per l'elaborazione di un saggio Virochip dall'inizio alla fine (i tempi di consegna ~ 24 ore), tra cui l'estrazione degli acidi nucleici del campione, amplificazione PCR con primer random, incorporazione colorante fluorescente, e l'ibridazione microarray, scansione e analisi.

Protocollo

I passi del saggio Virochip includono (1) l'estrazione degli acidi nucleici da campioni clinici, (2) trascrizione inversa di RNA estratto e 2 ^° fili sintesi di cDNA, (3) amplificazione di cDNA a caso innescato, (3) Cy3 incorporazione colorante fluorescente (4), l'ibridazione dei materiali marcati al microarray Virochip, e (5) scansione e analisi (Figura 1). Il protocollo illustrato di seguito dimostrerà l'uso del test Virochip su un campione di tampone nasale da un bambino con una malattia simil-influenzale.

Primer Sequenze

Primer Una 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-(N ₉₎ -3 '

Primer B-GTTTCCCAGTCACGATA 5'-3 '

1. Estrazione acido nucleico

1. Estrazione degli acidi nucleici da campioni clinici deve essere eseguita sotto livello di biosicurezza 2 (BSL-2) o più condizioni, in quanto questi campioni sono potenzialmente infetti.
2. Il campione tampone nasale viene trasportato in media tenendo virale. Aliquota 200 ml di campione in un tubo da microcentrifuga 1,5 ml Eppendorf.
3. Opzionale: passare campione attraverso un filtro a 0,22 micron (per purificare per particelle virali)
4. Opzionale: campione pretrattare con DNAsi (a degradare DNA genomico di accoglienza e per purificare protette, encapsidated nucleico virale) utilizzando il kit Turbo DNAsi (Ambion) secondo le istruzioni del costruttore
5. Estrarre l'esempio utilizzando il Zymo ZR Viral RNA Extraction Kit o kit Qiagen Virus Ultrasens secondo le istruzioni del produttore.

2. Trascrizione inversa e 2 ^° filamento sintesi CDNA ("Round A")

1. Aggiungere 1 uL 40 pmol / mL Primer A a 4 uL estratto RNA. Di calore a 65 ° C per 5 min in un termociclatore (ad esempio GeneAmp PCR System 9700) e poi lasciate raffreddare a temperatura ambiente x 5 min.
2. Aggiungere 5 ml di una master mix composto da 2 microlitri di buffer 5X RT, 1 microlitri 12,5 mm dNTP, 1 microlitri di acqua, 0,5 microlitri 0,1 M DTT, e 0,5 microlitri SSIII RT (Invitrogen). Incubare a 42 ° C x 60 minuti.
3. In un termociclatore programmabile, il calore a 94 ° C x 2 min (per interrompere la reazione della trascrittasi inversa), raffreddare a 10 ° C, centrifuga impulso, e poi aggiungere 5 microlitri Sequenase mix costituito da 1 tampone microlitri Sequenase 5X, 3,8 microlitri di acqua, e 0,15 Sequenase microlitri (USB Corporation). Per 2 ^° filone sintesi, rampa di salita da 10 ° C a 37 ° C oltre 8 minuti, per 8 minuti, poi il calore a 94 ° C x 2 min (per inattivare Sequenase) e raffreddare a 10 ° C (in attesa).
4. Optional: Rd Un campione di cDNA possono essere conservati a questo punto a -20 ° C.

3. Amplificazione PCR di primer CDNA casuale ("Rotonda B")

1. Aggiungere 5 uL di Rd Un campione a 45 ml di una master mix composto da 5 microlitri di buffer 10X PCR, 1 microlitri 12,5 mm dNTP, 1 ml 100 pmol / mL B primer, 1 ml KlenTaq LA (Sigma), e 37 microlitri di acqua.
2. Esegui Protocollo PCR come segue: 94 ° C, 2 min → (25 cicli di 94 ° C, 30 s / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 min) → 72 ° C, 5 min → 10 ° C ( attesa)
3. Controllare il campione Rd B su un 1,5% gel di agarosio. Uno striscio da circa 200 - 1000 bp dovrebbe essere visualizzate (Figura 2A)

4. Cy3 incorporazione colorante fluorescente

1. Opzionale: un altro campione può essere etichettato con il colorante fluorescente Cy5 e ibridizzato al microarray stesso.
2. Per incorporare aa-dNTP, aggiungere 5 uL di campione Rd B a 45 uL di una master mix composto da 5 uL tampone 10X PCR, 1 uL 12,5 mm aa-dNTP (Invitrogen), 1 uL 100 pmol / uL Primer B, 1, 1 uL KlenTaq LA (Sigma), e 37 uL acqua. Esegui Protocollo PCR come segue: 94 ° C, 2 min → (15 cicli di 94 ° C, 30 s / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 min) → 72 ° C, 5 min → 10 ° C ( attesa)
3. Pulire il campione Rd C con il DNA Pulire e Concentratore-5 Kit (Zymo ricerca) secondo le istruzioni del produttore. Eluire in 10 L.
4. Aggiungere 1 uL di bicarbonato 1M (Sigma) e 1 uL Cy5 (GE Healthcare) per il campione C Rd.
5. Incubare x 1 ora al buio.
6. Pulire il campione Cy3-etichettato con il DNA Pulire e Concentratore-5 Kit (Zymo ricerca) secondo le istruzioni del produttore. Eluire in 12 microlitri.

5. Ibridazione di Virochip Microarray

1. Optional: usare 1,5 microlitri per verificare la concentrazione cDNA e la quantità di colorante incorporato in uno spettrofotometro NanoDrop (per la normalizzazione dei campioni)
2. In un tubo striscia PCR aggiungere 1 microlitri frammentazione tampone 25X, 5 microlitri di buffer 5X blocco, 9,5 microlitri (o la quantità di normalizzare) di Cy3-etichettati campione, e l'acqua ad un volume totale di 25 microlitri (Agilent)
3. Aggiungere 25 ml di tampone 2X ibridazione Gex (Agilent). Spin down brevemente per rimuovere le bolle.
4. Carico massimo di 40 ml di campione sul vetrino guarnizione.
5. Luogo Agilent stampato Virochip array (Università di California, San Francisco / Agilent) (lato marcato "Agilent" verso il basso) sulla parte superiore della diapositiva guarnizione e fissare stringere.
6. Ibridare la notte in forno a 65 ° C, impostazione della velocità a 10 giri.
7. Per lavare gli array, preriscaldare tampone 2 (Agilent) a 37 ° C. Smontare guarnizioni scivolo / array subacquea panino in un tampone 1 (Agilent). Lavare in buffer di 1 x 1 min. Lavare in tampone preriscaldato 2 x 1 min. Rimuovere lentamente scivolare dal buffer 2, facendo attenzione ad evitare le bolle (uso kimwipe per favorire l'umidità in più facendo attenzione ad evitare di toccare direttamente lato attivo della matrice)
8. Luogo scivolare in supporto diapositive e inserire scanner array.

6. Virochip di scansione e analisi

1. Scansione Cy3 marcato serie a 5 micron o 2 micron secondo il protocollo standard di scansione dello strumento (Figura 2B).
2. Analizzare microarray Virochip mediante ispezione visiva, cluster analysis, o il programma di analisi automatica Virochip, E-Predict ^11. Da ciascuno di questi tre metodi, il virus dell'influenza sta prontamente rilevate nel campione tampone nasale (da un bambino con sindrome simil-influenzale) (Figura 2C)

7. Rappresentante dei risultati:

Quando il protocollo è fatto correttamente, uno striscio dovrebbe essere visto su elettroforesi su gel di agarosio dopo la fase di Rd B (Figura 2A). I microarray Virochip sulla piattaforma Agilent sarà difficile da analizzare visivamente (Figura 2B), ma se un virus è presente dovrebbe essere facilmente identificabili mediante ispezione visiva, cluster analysis, e / o E-Previsione (Figura 1C). I campioni possono essere addizionati con quantità determinata di acido nucleico da un virus conosciuto (ad esempio virus del mosaico del tabacco; batteriofago MS2) per servire come controllo positivo per il test.

Figura 1. Schematica del trattamento Virochip microarray e analisi. Estratta acidi nucleici da campioni clinici sono amplificati in modo casuale, etichettato con tinture fluorescenti e ibridato al microarray Virochip. Microarray sono state scansionate ad una risoluzione di 2 micron e analizzati utilizzando una varietà di strumenti di calcolo, tra cui E-prevedere.

Figura 2. Passi nel saggio Virochip Dopo l'amplificazione di PCR random, una macchia di 200 -. 1000 bp possono essere visualizzati mediante elettroforesi su gel (A) (B) Tre microarray Virochip su 8 array / vetrino vengono mostrati, con una piccola regione. di un microarray soffiato nella inserto nell'angolo in basso a destra. (C) di analisi automatizzata microarray virale con E-Prevedere rivelare la presenza del virus A nel campione clinico. Il punteggio di somiglianza elevata (s = 0,55) corrisponde ad un valore-p che è vicino a zero, rendendo questa una previsione estremamente significativa.

Discussione

Il protocollo Virochip come descritto qui è complessa e richiede un tecnico di ricerca meticolosa e competente. Concentrazioni dei reagenti corrette e le condizioni per la PCR, l'etichettatura, e l'ibridazione sono critici. Il protocollo Virochip può essere facilmente modificato per ospitare l'analisi dei tessuti malati con l'uso di un metodo di estrazione dei tessuti come TRIzol (Invitrogen) per l'estrazione degli acidi nucleici. Sonde possono essere aggiunti o eliminati come necessario per ottenere lo spettro desiderato e l'ampiezza di copertura, per esempio, sonde per la rilevazione di bersagli non virali come batteri e funghi possono essere progettati e ha aggiunto "on-the-fly". Alcune applicazioni del test Virochip attualmente in fase di sviluppo includono ampio spettro diagnostica virale nel laboratorio clinico, focolaio, lo screening della purezza di farmaci e vaccini, e la scoperta di nuovi agenti patogeni virali.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente / materiale	Nome del reagente / materiale
Primera	5'-GTTTCCCAGTCACGATA-(N9) -3 '
Primer B	5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3 '
RT Master Mix (5 mL)	2 microlitri di buffer RT 5X
	1 microlitri 12,5 mm dNTP (Invitrogen)
	1 acqua microlitri
	0,5 microlitri 0.1M DTT
	0,5 microlitri SSIII RT (Invitrogen)
Sequenase Mix (5 mL)	Buffer di 1 microlitri Sequenase 5X
	3,8 microlitri di acqua
	0,15 Sequenase microlitri (USB Corporation)
Rd B PCR Master Mix (45 mL)	5 microlitri di buffer PCR 10X
	1 microlitri 12,5 mm dNTP (Invitrogen)
	1 ml 100 pmol / mL Primer B
	1 ml KlenTaq LA (Sigma)
	37 microlitri di acqua
° C PCR Master Mix (45 mL)	5 uL Buffer PCR 10X
	1 microlitri 12,5 mm dNTP (Invitrogen)
	1 ml 100 pmol / mL Primer B
	1 ml KlenTaq LA (Sigma)
	37 microlitri di acqua
Ibridazione del buffer (25 mL)	Buffer di 1 microlitri frammentazione 25X (Agilent)
	5 microlitri di buffer 5X blocco (Agilent)
	9,5 microlitri (o la quantità di normalizzare) di Cy3 marcato campione
	Aggiungere acqua al volume totale di 25 microlitri
Agilent Virochip microarray	in attesa di licenza, disponibile da Chiu laboratorio, UCSF