Mit einem Pan-Viral Microarray-Assay (Virochip) zur klinischen Proben, die für virale Erreger Bildschirm

Zusammenfassung

Die Virochip ist ein pan-virale Microarray entwickelt, um gleichzeitig zu erkennen alle bekannten Viren sowie neue Viren auf der Basis von konservierten Sequenzhomologie. Hier zeigen wir, wie man ein Virochip Testlauf zu klinischen Proben auf das Vorhandensein von sowohl bekannte als auch unbekannte Viren zu analysieren.

Zusammenfassung

Die Diagnose von viralen Ursachen vieler Infektionskrankheiten ist schwierig aufgrund der inhärenten Reihenfolge Vielfalt der Viren sowie die laufende Aufkommen neuer viraler Erreger wie SARS-Coronavirus und 2009 pandemische H1N1-Influenza-Virus, die nicht nachweisbar sind mit herkömmlichen Methoden. Um diese Herausforderungen anzugehen, haben wir bereits entwickelt und validiert eine pan-virale Microarray-Plattform namens Virochip mit der Fähigkeit, alle bekannten Viren sowie neue Varianten auf Basis der konservierten Sequenz Homologie ^{1 zu} erfassen. Mit dem Virochip, haben wir das gesamte Spektrum der Viren mit Infektionen der Atemwege, einschließlich Fälle von ungeklärter critical illness bei hospitalisierten Patienten mit einer Empfindlichkeit entspricht oder überlegen gegenüber herkömmlichen klinischen Tests ^2-5 assoziiert identifiziert. Die Virochip wurde auch genutzt, um neue Viren zu identifizieren, einschließlich des SARS-Coronavirus ^6,7, einem neuartigen Rhinovirus Clade ^5, XMRV (ein Retrovirus in Verbindung mit Prostata-Krebs) ^8, Vogelgrippe Bornavirus (die Ursache eines Wasting Disease bei Papageien) ^9, und eine neuartige cardiovirus bei Kindern mit Atemwegs-und Durchfallerkrankungen ^10. Die aktuelle Version des Virochip hat zu einer Agilent Microarray-Plattform portiert worden und besteht aus ~ 36.000 Sonden aus über ~ 1.500 Viren in GenBank Stand Dezember 2009 abgeleitet. Hier zeigen wir die Schritte in der Bearbeitung eines Virochip Assay von Anfang bis Ende (~ 24 Stunden Bearbeitungszeit), einschließlich Probe Nukleinsäure-Extraktion, PCR-Amplifikation mit Random-Primern, Fluoreszenzfarbstoff Einarbeitung und Microarray-Hybridisierung, Scannen und Analyse.

Protokoll

Die Schritte des Virochip Assay umfassen (1) Nukleinsäure-Extraktion aus klinischen Proben, (2) reverse Transkription der RNA extrahiert und 2 ^{nd-cDNA-Synthese,} (3) PCR-Amplifikation von cDNA zufällig grundiert, (3) Cy3 Fluoreszenzfarbstoff Einbau (4), die Hybridisierung von markierten Materials auf die Virochip Microarray, und (5) Scannen und Analyse (Abbildung 1). Das Protokoll unten wird die Nutzung des Virochip Assay auf einem Nasenabstrich Probe aus einem Kind zeigen, mit einem Influenza-ähnliche Erkrankung.

Primersequenzen

Primer A 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-(N ₉₎ -3 '

Primer B-5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3 '

1. Nukleinsäure-Extraktion

1. Nukleinsäure-Extraktion aus klinischen Proben sollten unter Biosafety Level 2 (BSL-2) oder höher Bedingungen durchgeführt werden, da diese Proben potenziell infektiös sind.
2. Der Nasenabstrich Probe wird in virale Holding Medium transportiert. Aliquot 200 ul der Probe in ein 1,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäß.
3. Optional: pass Probe durch ein 0,22 um-Filter (für virale Partikel zu reinigen)
4. Optional: Vorbehandlung Probe mit DNAse (zum Host genomische DNA abbauen und reinigen für geschützte enkapsidiert viralen Nukleinsäure) mit dem Turbo DNAse Kit (Ambion) gemäß den Anweisungen des Herstellers
5. Entpacken Sie die Probe mit dem Zymo ZR Viral RNA Extraction Kit oder Qiagen UltraSens Virus Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.

2. Reverse Transkription und 2 ^{nd-cDNA-Synthese} ("Round A")

1. Add 1 UL 40 pmol / ul Primer A bis 4 uL extrahierte RNA. Hitze bis 65 ° C für 5 min in einem Thermocycler (zB GeneAmp PCR System 9700) und dann abkühlen lassen bei Raumtemp x 5 min.
2. Add 5 ul einer Master-Mix bestehend aus 2 ul 5X RT-Puffer, 1 ul 12,5 mM dNTP, 1 ul Wasser, 0,5 ul 0,1 M DTT und 0,5 ul SSIII RT (Invitrogen). Inkubation bei 42 ° C x 60 Minuten.
3. In einem programmierbaren Thermocycler, Hitze bis 94 ° C x 2 min (zum Abbruch der Reverse-Transkriptase-Reaktion), kühl bis 10 ° C, Puls Zentrifuge, und fügen Sie dann 5 ul Sequenase Mix, bestehend aus 1 ul 5X Sequenase Puffer, 3,8 ul Wasser, und 0,15 ul Sequenase (USB Corporation). Für 2 ^{nd-Strang-Synthese,} Rampe von 10 ° C bis 37 ° C über 8 min, 8 min halten, dann Hitze auf 94 ° C x 2 min (zu Sequenase inaktivieren) und kühlen bis 10 ° C (halten).
4. Optional: Rd Ein Beispiel cDNA kann an dieser Stelle bei -20 ° C gelagert werden

3. PCR-Amplifikation zufällig Primed cDNA ("Round B")

1. Add 5 ul Rd Eine Stichprobe von 45 ul einer Master-Mix bestehend aus 5 ul 10x PCR-Puffer, 1 ul 12,5 mM dNTP, 1 ul 100 pmol / ul Primer B, 1 ul KlenTaq LA (Sigma) und 37 ul Wasser.
2. Run PCR-Protokoll wie folgt: 94 ° C, 2 min → (25 Zyklen von 94 ° C, 30 s / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 min) → 72 ° C, 5 min → 10 ° C ( halten)
3. Überprüfen Sie die Rd B-Probe auf einem 1,5% Agarose Elektrophorese-Gel. Ein Abstrich aus ca. 200 - 1000 bp sollte visualisiert werden (Abb. 2A)

4. Cy3 Fluoreszenzfarbstoff Incorporation

1. Optional: ein weiteres Beispiel kann mit dem Cy5 Fluoreszenzfarbstoff markiert werden und hybridisiert die gleichen Microarray.
2. Zur Einarbeitung aa-dNTP, mit 5 ul Rd B-Probe zu 45 uL einer Master-Mix bestehend aus 5 uL 10x PCR-Puffer, 1 uL 12,5 mM aa-dNTP (Invitrogen), 1 uL 100 pmol / ul Primer B, 1, 1 UL KlenTaq LA (Sigma) und 37 uL Wasser. Run PCR-Protokoll wie folgt: 94 ° C, 2 min → (15 Zyklen von 94 ° C, 30 s / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 min) → 72 ° C, 5 min → 10 ° C ( halten)
3. Reinigen Sie die Rd C Probe mit den DNA Clean and Concentrator-5 Kit (Zymo Research) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Eluieren in 10 ul.
4. Add 1 ul 1M Bicarbonat (Sigma) und 1 uL Cy5 (GE Healthcare), die Rd C Probe.
5. Inkubieren x 1 Stunde im Dunkeln.
6. Reinigen Sie die Cy3-markierten Probe mit den DNA-Clean and Concentrator-5 Kit (Zymo Research) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Eluieren in 12 ul.

5. Hybridisierung zu Virochip Microarray

1. Optional: Verwendung 1,5 ul der cDNA-Konzentration und der Menge an Farbstoff auf einem Nanodrop Spektrophotometer aufgenommen zu überprüfen (zur Normalisierung der Proben)
2. In einer PCR-Streifen Rohr add 1 ul 25X Fragmentierung Puffer, 5 ul 5X Blockierungspuffer, 9,5 ul (oder die Menge zu normalisieren) von Cy3-markierten Probe, und Wasser zu einem Gesamtvolumen von 25 ul (Agilent)
3. Add 25 ul 2X GEx Hybridisierungspuffer (Agilent). Spin down kurz, um Luftblasen zu entfernen.
4. Legen Sie 40 ul der Probe auf Dichtung schieben.
5. Ort Agilent-gedruckt Virochip array (University of California, San Francisco / Agilent) (Seite mit der Aufschrift "Agilent" down) auf der Oberseite der Dichtung schieben und befestigen Sie Schraube fest.
6. Hybridisierung über Nacht in 65 ° C Backofen, Drehzahleinstellung bei 10 Umdrehungen pro Minute.
7. Um Arrays, Vorwärmen Puffer 2 (Agilent) auf 37 ° C waschen Nehmen Sie Abstand Dichtung schieben / array Sandwich Unterwasserwelt in Puffer 1 (Agilent). Wash in Puffer 1 x 1 min. Wash in vorgewärmten Puffer 2 x 1 min. Langsam entfernen Folie aus Puffer 2, wobei darauf zu Blasen zu vermeiden (Verwendung Kimwipe weg Docht zusätzliche Feuchtigkeit wird sorgfältig vermieden direkt berühren aktive Seite des Arrays)
8. Legen Sie gleiten in Diahalter und insert into Array-Scanner.

6. Virochip Scanning und Analyse

1. Scan Cy3-markierten Array mit 5 &mgr; m oder 2 um je nach Instrument der Standard-Scan-Protokoll (Abbildung 2B).
2. Analysieren Virochip Microarrays durch visuelle Inspektion, Cluster-Analyse oder die automatisierte Virochip Analyse-Programm, E-Predict ^11. Mit jeder dieser drei Methoden ist Influenzaviren leicht in der Nasenabstrich Probe (von einem Kind mit Grippe-ähnliche Erkrankung) (Abbildung 2C) erkannt

7. Repräsentative Ergebnisse:

Wenn das Protokoll korrekt erledigt ist, sollte ein Abstrich auf Agarosegelelektrophorese nach dem Rd B Schritt (Abbildung 2A) gesehen werden. Die Virochip Microarray auf der Agilent-Plattform wird schwierig sein, visuell zu analysieren (Abbildung 2B), aber wenn ein Virus vorhanden ist, sollte leicht durch Sichtkontrolle, Cluster-Analysen und / oder E-Predict (Abbildung 1C) identifiziert werden. Als positive Kontrolle für den Test dienen, können Proben mit gemessenen Mengen von Nukleinsäure aus einem bekannten Virus (MS2 Bakteriophage zB Tabak-Mosaik-Virus) versetzt werden.

Abbildung 1. Schematische Darstellung der Virochip Microarray-Verarbeitung und Analyse. Extrahierte Nukleinsäure aus klinischen Proben werden nach dem Zufallsprinzip amplifiziert, markiert mit Fluoreszenzfarbstoffen und hybridisiert die Virochip Microarray. Microarrays sind bei 2 mm Auflösung gescannt und analysiert mit einer Vielzahl von rechnerischen Werkzeugen, einschließlich E-vorherzusagen.

Abbildung 2. Schritte in die Virochip Assay Nach der Verstärkung durch zufällige PCR, ein Abstrich von 200 -. 1000 bp sichtbar gemacht werden durch Gelelektrophorese (A) (B) Drei Virochip Microarrays aus dem 8 Arrays / Objektträger aus Glas dargestellt, mit einer kleinen Region. eines Microarray aufgeblasene im Einschub auf der rechten unteren Ecke. (C) Automated Microarray-Analyse mit viralen E-Predict enthüllt die Anwesenheit von Influenza A-Virus in der klinischen Probe. Die hohe Ähnlichkeit Score (s = 0,55) entspricht einem p-Wert, der nahe bei Null liegt, wodurch dieser eine äußerst signifikante Vorhersage.

Diskussion

Die Virochip Protokoll, wie hier beschrieben ist komplex und erfordert eine sorgfältige und qualifizierte Forschungs-Techniker. Richtig Reagenz-Konzentrationen und Bedingungen für die PCR, Kennzeichnung und Hybridisierung sind kritisch. Die Virochip Protokoll kann leicht modifiziert werden, um die Analyse der erkrankten Geweben durch die Verwendung eines Gewebes Extraktionsmethode wie TRIzol (Invitrogen) zur Nukleinsäure-Extraktion unterzubringen. Probes können hinzugefügt oder gelöscht werden, wie notwendig, um das gewünschte Spektrum und Breite der Abdeckung zu erzielen, z. B. Sonden zum Nachweis von viralen Ziele wie Bakterien und Pilze können entwickelt und hinzugefügt werden "on-the-fly". Einige Anwendungen des Virochip Assay derzeit in Entwicklung sind Breitspektrum-virale Diagnostik im klinischen Labor, Ausbruch Untersuchung, Reinheit Screening von Medikamenten und Impfstoffen sowie neuartige virale Erreger entdeckt.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenz / Material	Name des Reagenz / Material
Primera	5'-GTTTCCCAGTCACGATA-(N9) -3 '
Primer B	5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3 '
RT Master Mix (5 ul)	2 ul 5X RT-Puffer
	1 ul 12,5 mM dNTP (Invitrogen)
	1 ul Wasser
	0,5 ul 0,1 M DTT
	0,5 ul SSIII RT (Invitrogen)
Sequenase Mix (5 ul)	1 ul 5X Sequenase Puffer
	3,8 ul Wasser
	0,15 ul Sequenase (USB Corporation)
Rd B PCR Master Mix (45 ul)	5 ul 10x PCR-Puffer
	1 ul 12,5 mM dNTP (Invitrogen)
	1 ul 100 pmol / ul Primer B
	1 ul KlenTaq LA (Sigma)
	37 ul Wasser
Rd C PCR Master Mix (45 ul)	5 ul 10x PCR-Puffer
	1 ul 12,5 mM dNTP (Invitrogen)
	1 ul 100 pmol / ul Primer B
	1 ul KlenTaq LA (Sigma)
	37 ul Wasser
Hybridisierungspuffer (25 ul)	1 ul 25X Fragmentierung Puffer (Agilent)
	5 ul 5X Blocking-Puffer (Agilent)
	9,5 ul (oder die Menge zu normalisieren) von Cy3-markierten Probe
	Fügen Sie Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 25 ul
Agilent Virochip Microarray	Lizenz angemeldet, verfügbar ab Chiu Labor, UCSF