Xenotrasplante ortotópico de los Derechos Humanos-luciferasa Tagged células malignas del tumor vaina de nervio periférico para In vivo Pruebas de candidatos a agentes terapéuticos

Resumen

Un método de injerto de forma fiable la luciferasa-etiquetados humanos malignos de los nervios periféricos células del tumor de la vaina en el nervio ciático de ratones inmunodeficientes se describe. El uso de imágenes de bioluminiscencia para demostrar establecimiento adecuado de los injertos de tumor y los criterios de segregación aleatoria de los animales en grupos de estudio también se discuten.

Resumen

Aunque en las pantallas in vitro son esenciales para la identificación inicial de posibles agentes terapéuticos, una evaluación rigurosa de la capacidad del medicamento para inhibir el crecimiento del tumor debe realizarse en un modelo animal adecuado. El tipo de modelo animal que es el mejor para este propósito es un tema de intensa discusión. Cierta evidencia indica que los ensayos preclínicos que evaluaron los efectos de drogas en los tumores que surgen en ratones transgénicos son más predictivos de los resultados clínicos y lo que los agentes ^un candidato terapéutico a menudo se prueba en estos modelos. Desafortunadamente, los modelos transgénicos no están disponibles para muchos tipos de tumores. Además, los modelos transgénicos a menudo tienen otras limitaciones como la preocupación en cuanto a qué tan bien los modelos tumorales de ratón de su contraparte humana, penetrancia incompleta del fenotipo tumoral y una incapacidad para predecir cuando los tumores se desarrollan.

En consecuencia, muchos investigadores utilizan modelos de xenoinjerto (células tumorales humanas injertadas en ratones inmunodeficientes) para ensayos preclínicos en su caso los modelos tumorales transgénicos no están disponibles. Incluso si se dispone de modelos transgénicos, a menudo asociado con los modelos de xenoinjerto como el último de facilitar la rápida determinación de los rangos terapéuticos. Además, esta asociación permite una comparación de la eficacia del agente en los tumores de transgénicos y genuina células tumorales humanas. Históricamente, los xenoinjertos ha sido a menudo realiza mediante la inyección de células tumorales por vía subcutánea (xenoinjertos ectópico). Esta técnica es rápida y reproducible, relativamente barata y permite la cuantificación continua de crecimiento tumoral durante el período terapéutico ^2. Sin embargo, el espacio subcutáneo no es el microambiente normal para la mayoría neoplasias y los resultados así obtenidos con xenoinjerto ectópico puede ser engañoso debido a factores tales como la ausencia de órganos específicos de la expresión de los tejidos del huésped y los genes del tumor. Así, ha sido fuertemente recomendado que los estudios de injerto ectópico ser sustituido o complementado con estudios en los que las células de tumores humanos son injertados en su tejido de origen (xenoinjertos ortotópico) ^2. Desafortunadamente, la implementación de esta recomendación es a menudo frustrado por el hecho de que las metodologías ortotópico xenoinjertos todavía no se han desarrollado para muchos tipos de tumores.

Los tumores malignos de la vaina nerviosa periférica (MPNSTs) son sarcomas muy agresivos que se producen de forma esporádica o en asociación con neurofibromatosis tipo 1 y ³ con más frecuencia se plantean en el nervio ciático ^4. Aquí se describe un método técnicamente sencillo en el que luciferasa de luciérnaga-etiquetados células MPNST humanos orthopically transplantados en el nervio ciático de ratones inmunodeficientes. Nuestro enfoque para evaluar el éxito del procedimiento de injerto en los animales y la asignación al azar posteriores no sesgada en los grupos de estudio también se examina.

Protocolo

1. Preparación inicial de no-nude ratones inmunodeficientes (no es necesario para las cepas Desnudos):

1. Todos los procedimientos fueron revisados ​​y aprobados previamente por el Cuidado de Animales de la UAB institucional y el empleo y la llevada a cabo por personal debidamente capacitado. Hemos utilizado con éxito tres cepas de ratones inmunodeficientes para estos experimentos: una Foxchase) outbred ratones SCID (CB17/lcr- Prkdc ^scid / lcrCrl ratones), b) NIH III ratones (NIHS-Lyst ^bg Foxn1 ^nu BRK ratones ^XID), y c ) NOD-SCIDγ ratones (NOD.Cg-Prkdc ^scid Il2rg ^tm1Wjl / SzJ ratones). En nuestras manos, el crecimiento de xenoinjertos ortotópico es prácticamente idéntico en los NIH III y NOD-SCIDγ ratones, los cuales son portadores de mutaciones que afectan a la función de las células T, células B y células NK, por este protocolo, el número de días requeridos para el injerto crecimiento, el momento en que se inicia la terapia y los tiempos post-injerto cuando la imagen se lleva a cabo son los que han determinado empíricamente utilizando SCIDγ NOD-ratones. Crecimiento del injerto en Foxchase outbred ratones SCID, que tienen defectos en T y B función de las células, por lo general toma más tiempo.
2. Para facilitar el injerto de un gran número de no-nude ratones inmunodeficientes, que elimina el vello de la zona a operar en la tarde anterior al injerto. Los ratones son anestesiados utilizando una cámara de inducción con isoflurano conectado a un vaporizador para limpiar los gases de escape. Para mantener la temperatura corporal, los animales se manejan en una almohadilla térmica a lo largo de este proceso. Clippers se utilizan para eliminar el vello de la media de la espalda hacia abajo de la rodilla de la pata trasera en el lado que se va a injertar. Cualquier resto del cabello es cuidadosamente eliminado del sitio de ~ 5 minutos utilizando un agente depilatorio químico (por ejemplo, Nair, en particular un producto con aloe vera para la piel sensible). La extracción del producto depilatorio es recomendable ya que puede conducir a la irritación de la piel, los ojos y otras superficies del cuerpo al que se extienda. No injerto ambos nervios ciáticos en estos experimentos, ya que puede dañar la función bilateral pata, resultando en la pérdida de los ratones de los grupos de estudio.
3. Los ratones se les permite recuperarse totalmente de una almohadilla de calefacción en una jaula de aislamiento sin ropa de cama, lo que tanto se asegura de que los ratones no son heridos por otros animales, más alerta y evita que accidentalmente la inhalación de ropa de cama. Cuando los ratones son totalmente móviles y no muestran evidencia de somnolencia, que puede ser presentada de nuevo en una jaula con otros ratones.

2. Preparación de las células MPNST para inyección en el Día del injerto

1. En este protocolo, los números específicos de las células injertadas y los tiempos requeridos para el crecimiento de tumores post-injerto son los que han determinado empíricamente para ST88-14 células, una línea común MPNST que se deriva de un tumor asociado a NF1 ^5. Las células que utilizamos para el injerto se han transducidas con un vector lentiviral que contiene una cinta de CMV-luciferasa-IRES-puromicina y los clones que expresan establemente luciferasa de luciérnaga identificados por la bioluminiscencia de imágenes ^6. También hemos realizado el injerto experimentos con células MPNST transfectadas establemente con plásmidos que expresan luciferasa de luciérnaga bajo el control de la CMV promotor temprano inmediato. No recomendamos esto, ya que han encontrado que estos vectores plasmídicos son propensos a someterse a la extinción de la siguiente expresión de injerto.
2. ST88-14 células se cultivan en medio esencial mínimo de Dulbecco suplementado con 10% de suero fetal bovino, 10 mg / ml de estreptomicina y 10 UI / ml de penicilina (DMEM10), 5 mg / ml puromycin también se incluye para mantener la selección para el vector lentiviral. Hemos mantenido estas células en nuestro laboratorio para 50 pasajes y no han observado ninguna variación en el crecimiento celular en cualquiera de estos pasajes. 9 x 10 ⁵ ST88-14 células se colocan en un matraz T175 y cultivadas durante 3 días, momento en el que el frasco es de aproximadamente 80% confluente. De injerto 35 ratones, una sola el 80% confluentes T175 frasco es necesario; en esta densidad, nuestro rendimiento medio de las células ST88-14 es de 7,3 x 10 ⁶ células por frasco T175. Es muy importante que las células no se les permite crecer hasta la confluencia antes de la cosecha para el injerto. Hemos encontrado que las células de los resultados cosechados injerto frascos confluentes en un grado más alto de fracaso del injerto y, a menudo se prolonga el curso vivo en el crecimiento del injerto.
3. ST88-14 células se lavan una vez con solución salina balanceada de Hanks a temperatura ambiente. Las células se extraen del frasco con Stripper celular disociación celular solución durante 30 segundos a 1 minuto a temperatura ambiente. Cinco mililitros de DMEM10 (Nota: puromicina no está incluido en este medio) por cada mililitro de Stripper celulares usados ​​se añaden a las células.
4. Las células se contaron usando un hemocitómetro. 5 x 10 ³ ST88-14 células suspendidas en 3 l se inyecta por ratón. Una cantidad de células suficientes para injerto de toda la cohorte, con una previsión de pipeteoerror (por ejemplo, de 35 ratones, por lo general la transferencia de un número de células suficiente para injerto de 40 ratones), se transfiere a un tubo estéril de 1,5 ml. Las células se centrifugan a 3000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se retira cuidadosamente y el sedimento celular resuspendido en DMEM10 (Nota: puromicina no está incluido en este medio) a una concentración final de 5 x 10 ³ células por 3 mL. Mantener las células en hielo.

3. Injerto de Protocolo

1. Los ratones son anestesiados en la cámara de la inducción de un vaporizador isoflurano hasta que ya no retirar sus patas traseras a un estímulo pizca dedo del pie. Los ratones son colocados de lado y se inyecta por vía subcutánea con 0,05 mg / kg de hidrocloruro de buprenorfina. Anestesia y se mantiene a través de la administración continua de isoflurano entregado a través de ojiva. Tenga en cuenta que los ratones sacrificados fue utilizado para demostrar este procedimiento para el video y, en consecuencia, la tubería de isoflurano utilizados para entregar el isoflurano no se ve en el video.
2. Para mantener la temperatura corporal, los animales se manejan en una almohadilla de calefacción en todo el proceso de injerto. Para evitar la desecación corneal, una pequeña gota de pomada oftálmica (pomada Puralube veterinarios) se administra a cada ojo. Ya que será necesario que cada ratón para identificar de forma exclusiva durante todo el juicio, una marca auricular con un número identificador único y se recorta en la oreja derecha de cada ratón.
3. Lugar en el estómago de los animales, propagación de las patas traseras. Cubrir el ratón con un paño estéril, la exposición de la ventana quirúrgica (flanco), donde se produce el injerto. El campo estéril debe permitir la visualización de la cabeza, tanto para garantizar que la nariz todavía está dentro del cono y permitir un control de la respiración y el color del animal. Aplicar betadine en el sitio quirúrgico con un aplicador con punta de algodón, comenzando en el centro de la banda y poco a poco en espiral hacia el exterior a los bordes de la ventana quirúrgica. Etanol al 70% se aplica a la herida quirúrgica de la misma manera. Aplicaciones consecutivas de betadine seguido por el etanol se repite dos veces más.
4. Eliminar las células de hielo y ya sea suavemente o vórtice del tubo de película para volver a suspender las células se establecieron. Con una pipeta, extraiga 3,2 l de la suspensión celular y expulsarlo en un trozo de Parafilm. Mediante la eliminación de más de lo necesario y la colocación de la suspensión de Parafilm, podemos asegurar que no haya burbujas en la suspensión y que tenemos un total de 3 l de la inyección. Tirar tanto de la suspensión celular sea posible en una jeringa de 10 l Hamilton equipado con una aguja de calibre 33. Burbujas de Flick de la jeringa y expulse el exceso de suspensión de células de exactamente 3 l. Mantener las células y la jeringa que contiene las células en hielo hasta que esté listo para usar, para asegurar que la aguja es estéril, no permiten el contacto con el hielo o la cuchara. Un trozo de Saran Wrap puede ser colocado en la parte superior del hielo a la jeringa de contacto directo con el hielo.
5. El uso de un bisturí N º 4 cuenta con una hoja de bisturí N º 22, hace una incisión a través de la piel del flanco justo debajo y paralela al fémur, asegúrese de que la incisión no se extiende más allá de los límites del campo quirúrgico plano. Abrir la incisión de la piel con una pinza quirúrgica o de forma manual para exponer el músculo subyacente. Un avión de la fascia será visible a lo largo de la longitud de la pierna, el nervio ciático se encuentra debajo de este, y entre los dos músculos conectados por la fascia. Con un par de tijeras de punta afilada, contundente disección a través de esta fascia para exponer el nervio ciático, que debería ser evidente que una estructura lineal blanco sobre el grosor de un hilo grueso.
6. Con un par de pinzas de punta afilada curvada, con cuidado en la disección del nervio, que el aflojamiento de los músculos subyacentes, lo que tanto eleva y aísla los nervios. Deje las pinzas en el valor de mantener esta posición. Inserte cuidadosamente la aguja de la jeringa Hamilton en el nervio, tratando de mantener el ángulo de la inyección como en paralelo con el nervio como sea posible para que la aguja no punción a través de la parte inferior del nervio. La aguja debe insertarse al final del nervio distal a la columna vertebral, hemos encontrado que la inyección de células tumorales en los nervios hacia la médula espinal, establece que las células tumorales injertadas más cerca de la médula espinal. Cuando esto ocurre, las células del tumor a menudo invaden la médula espinal, lo que resulta en la pérdida prematura de los animales del grupo de estudio debido al compromiso de la función de la médula espinal.
7. Una vez que la aguja está colocada correctamente en el nervio, relajar la tensión que se produce en el nervio por la pinza y lentamente inyectar células de la jeringa en el nervio más de 45-60 segundos. Es esencial que esto se haga poco a poco con la mayor rapidez la expulsión del contenido de la jeringa se traducirá en un "back-wash" de las células tumorales en todo el sitio de la inyección y su pérdida. Después de todas las células se han inyectado con éxito, extraiga lentamente la aguja para minimizar la pérdida de material inyectado.
8. Para quitar laceps y coloque cuidadosamente los nervios de nuevo en su ubicación original en el músculo. Cerrar la incisión quirúrgica con pegamento quirúrgico Vetbond. Mantenga la incisión con pinzas durante aproximadamente 20 segundos para permitir que el pegamento se seque.
9. El ratón se retira de la isoflurano ojiva y se coloca solo en una jaula de ropa de cama libre para recuperarse. Esta jaula debe mantenerse en la cima de una almohadilla de calefacción hasta que el animal se ha recuperado completamente. Parte de la jaula de recuperación no debería estar en una almohadilla eléctrica, esto permite que el animal se mueva lejos del calor si se calientan demasiado. Siguientes patrones, los animales deben ser evaluados periódicamente para masticar en el lugar, la cojera o la anorexia, estos signos pueden indicar que el animal está todavía en el dolor y que los analgésicos adecuados se debe administrar. Después de adquirir experiencia con este procedimiento, hemos encontrado que los ratones 30-40 fácilmente pueden ser injertadas en un solo día.

4. La evaluación del éxito del injerto y la aleatorización en grupos de estudio

1. Imágenes de bioluminiscencia se utiliza para evaluar el éxito del procedimiento de injerto. Utilizamos un sistema IVIS-100 (originalmente de Xenogen, que ahora se conoce como pinzas Inc.) para detectar la emisión de luz de tumor expresa luciferasa de luciérnaga que se produce como resultado de la reacción química de la luciferasa con su sustrato, D-luciferina . El análisis de estas imágenes específicas determinar si los ratones injertados son adecuados para la entrada en las cohortes de ensayo terapéutico. En experimentos preliminares, hemos cuantificado las señales de bioluminiscencia detectable, se sacrificaron los ratones injertados, cosechado sus tumores y se correlacionó el peso del tumor con las señales de la bioluminiscencia de la región de los análisis de interés con el software del fabricante de la imagen de estar. Estos estudios demostraron que existe una correlación lineal entre el peso de implantación del tumor y la emisión de luz bioluminiscencia, lo que indica que las imágenes de bioluminiscencia es un medio apropiado sustituto de evaluar el crecimiento de xenoinjertos en el transcurso de los ensayos preclínicos. Típicamente la imagen 5 ratones al mismo tiempo. Detalles adicionales sobre imágenes de bioluminiscencia se publicó anteriormente con el ^7.
2. Para evaluar el éxito del injerto, imágenes de bioluminiscencia se realiza 1 y 3 días después de injertar. Las imágenes se obtienen de los ratones orientados en la misma posición 10 minutos después de la inyección intraperitoneal de 2,5 mg D-luciferina. Durante estas pruebas, los ratones se mantienen bajo anestesia con isoflurano y su temperatura corporal se mantuvo a 37 ° C por una almohadilla caliente en la cámara Xenogen. Tiempos de adquisición de imágenes se encuentran en el rango de 2 segundos a 10 minutos, el software de adquisición de datos se asegura de que ningún píxel se saturan durante la recolección de la imagen. Emisión de luz de las regiones del tumor (conteos relativos fotones / seg) se mide con el software propietario de Xenogen. La intensidad de emisión de luz está representada por la ampliación pseudocolor de la bioluminiscencia que se superpone en las fotografías en blanco y negro de los ratones que se recogen al mismo tiempo.
3. Para ser elegibles para su inclusión en una cohorte de estudio preclínico, los ratones deben tener una señal detectable tanto bioluminiscencia 1 y 3 días post-injerto y la intensidad de la señal de bioluminiscencia debe aumentar entre los días 1 y 3. Los animales que tienen una señal de disminución o estáticos son excluidos. Además, las señales detectadas en ratones injertados en el mismo día debe estar dentro de un orden de magnitud de unos a otros; ratones con señales de bioluminiscencia que son un orden de magnitud inferiores o superiores a los detectados en animales injertados en el mismo día también están excluidos.
4. Una vez que los ratones han sido identificados que cumplen estos criterios, deben ser asignados al azar a los grupos de tratamiento. Para lograr esto, las señales de luciferasa detectado en ratones injertados 3 días post-injerto son primero ordenados de mayor a menor intensidad. Los ratones son luego distribuidos aleatoriamente en grupos mediante la asignación en orden de intensidad a los grupos de tratamiento, invirtiendo el orden y luego repetir el proceso hasta que todos los ratones se les asigna a los grupos. Por ejemplo, si hay 4 grupos de tratamiento (por ejemplo, el placebo y tres concentraciones de fármaco en estudio) de los ratones se les asigna a los grupos en el orden 1, 2, 3, 4, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3 , 4, 4, 3, 2, 1 .. etc Antes de iniciar el tratamiento, la bioluminiscencia señales detectadas en cada miembro del grupo asignado se promedian para asegurarse de que las señales de media a partir dentro de todos los grupos estén lo más cerca posible. La administración del agente candidato terapéutico se inicia el día 3.
5. Para evaluar el efecto del agente terapéutico tiene en el crecimiento del injerto durante el curso del tratamiento, imágenes de bioluminiscencia se realiza una vez a la semana después de comenzar la terapia (días 10, 17, 24, 30 post-injerto). Para los no-nude ratones inmunodeficientes, es de vital importancia que los animales tienen un crecimiento de nuevo pelo nuevo eliminado con Nair antes de realizar cada sesión de imágenes. Esto se debe a los bloques de pelo señales bioluminiscentes, con el color del pelaje determinar la cantidad de la señal se pierde. Por ejemplo, la piel blanca como se encuentra en Suiza WEbster ratones produce una reducción del 18% en la intensidad de la señal bioluminiscente ^8, mientras que pelo negro puede reducir las señales de hasta 10 veces ^9. También nos cuenta que no se puede suponer que el nuevo crecimiento de piel uniforme se producirá en todos los grupos de tratamiento y "normalizar" la reducción de la señal entre los grupos de tratamiento. Esto se debe a que el agente terapéutico en sí mismo puede afectar el crecimiento del cabello. Por ejemplo, hemos observado que el tratamiento con tamoxifeno inhibe el crecimiento del cabello, lo que minimiza el efecto percibido de este agente sobre el crecimiento tumoral en comparación con los ratones tratados con placebo.
6. Con células ST88-14 MPNST, los ratones se puede realizar durante 30 días post-injerto. En este momento, los tumores típicamente han crecido hasta el tamaño máximo permitido por el cuidado de animales y de los comités institucionales uso y debe ser sacrificado. Tras la sesión de imágenes final, los ratones son sacrificados y necesarios muestras para su posterior análisis de los resultados del tratamiento (por ejemplo, sangre para la determinación de los niveles circulantes del agente terapéutico, el tejido del tumor para determinar el peso, el examen de la histología, la determinación de los índices de Ki67 y TUNEL etiquetado y evaluación de los parámetros bioquímicos) recogidos. Precisamente lo que las muestras se recogen dependerá de las necesidades del diseño experimental.
7. Los ratones con tumores deben ser controlados diariamente y terminada en caso de enfermarse (grooming falta normal y las conductas de evitación), son incapaces de comer o beber, o si el tumor se vuelve demasiado grande como para dificultar los movimientos normales del cuerpo. La carga tumoral no se debe permitir a superar el 10% del peso corporal del animal normal. El peso del tumor como un porcentaje del peso corporal se calcula comparando el peso de los animales portadores del tumor con el peso de la edad / sexo emparejado los animales control. La caquexia no se debe permitir a convertirse en clínicamente significativa. Pérdida de peso en los animales portadores de tumores no deben superar el 20% del peso corporal normal.

5. Los resultados representativos:

La Figura 1 ilustra el aumento progresivo de la bioluminiscencia típico observado 1 a 18 días post-injerto en un xenotrasplante ortotópico debidamente establecido en un desnudo (NIH III) ratón (AC). La cuantificación de las señales de bioluminiscencia observada 24.1 días después del trasplante muestra que, a pesar de estas señales aumentan de manera progresiva, se acelera el crecimiento del tumor notablemente en las últimas etapas del período de estudio (Figura 1 D). Para demostrar rigurosamente que el crecimiento del tumor en los ratones injertados, de manera rutinaria recoger el nervio ciático y, si parece que el tumor se ha roto el epineuro y ha invadido los tejidos adyacentes, los tejidos blandos circundantes y el músculo esquelético. Teniendo en cuenta el crecimiento agresivo de MPNSTs, no es de extrañar que a menudo encontramos que las células tumorales injertadas ha roto las barreras normales del nervio e invadido los tejidos adyacentes (Figura 1). También a menudo encuentran que las células injertadas MPNST migrar agresivamente en el nervio proximal y distal a la zona del injerto.

Figura 1. Imágenes de bioluminiscencia de NIH III ratón ortotópicamente injertados con luciferasa-etiquetados células MPNST un día post-injerto (A). Tenga en cuenta que las señales detectadas en la región de interés (ROI) en diferentes ratones se encuentran a un orden de magnitud de cada uno. Creación de imágenes de 10 días (B) y 18 días (C) post-injerto que muestra señales bioluminiscentes aumentan progresivamente en el sitio del injerto en ratones individuales. (D) Gráfico que ilustra el aumento progresivo de la cuenta relativa fotón / segundo detectados en el sitio del injerto 1-24 días post-injerto. (E) Microfotografía del sitio del injerto a partir de este ratón que demuestra el crecimiento del tumor y la invasión focal en el músculo esquelético adyacente.

Discusión

El método detallado ortotópico xenoinjertos se presenta aquí es que hemos desarrollado con ST88-14 células MPNST, una línea que es ampliamente utilizado en los estudios de estos NF1 tumores asociados de vaina nerviosa periférica. Sin embargo, esta metodología es fácilmente adaptable a los estudios preclínicos con otras líneas de células MPNST. Por ejemplo, también hemos realizado ortotópico xenoinjertos con la misión STS-26T ¹⁰ células, una línea derivada de una aparición esporádica MPNST y T265-2c células ^11, que se derivan de un MPNST NF1 asociados, con un éxito similar al que observamos con ST88 -14 células.

Dicho esto, cabe señalar que las condiciones exactas que describimos aquí para ortotópico xenoinjertos de ST88-14 células no pueden ser adoptadas directamente por el injerto de las líneas de MPNST otros. En cambio, los parámetros clave de la metodología debe ser determinada empíricamente para cada línea celular. Estos parámetros incluyen el número de células MPNST inicialmente el injerto en el tiempo permitido para el desarrollo del injerto y, en menor medida, el volumen en el que las células tumorales se inyectan. Para establecer estos parámetros para una nueva línea, que los grupos de injerto de ratones (5 ratones por grupo) con 10 ³ a 5 x 10 ⁶ células tumorales, el control de las concentraciones de dos células de cada orden de magnitud (es decir, 10 ³ células, 5 x 10 ³ células, 10 ⁴ células, 5 x 10 ⁴ células, etc.) Un mayor número de células tumorales (> 10 ⁶⁾ se debe inyectar en un volumen mayor, hemos encontrado que hasta un 5 ml se puede inyectar sin pérdida de las células del nervio injertado. También hemos encontrado que no más de 5 x 10 ⁶ células tumorales por volumen de 5 ml se puede inyectar en forma de suspensiones más denso cada vez más propensos a la corte que mata las células tumorales. Seguimos estos ratones hasta por lo menos tres animales en cada grupo tienen tumores palpables, momento en el que damos por terminado ese grupo y examinar el nervio histológico para confirmar el crecimiento del injerto. Obviamente, el tiempo necesario para llegar a este punto serán diferentes, dependiendo del número de células inyectadas, en general, estamos buscando a una concentración de células que se alcance el máximo crecimiento del tumor permitida dentro de 30-60 días. Un crecimiento más rápido puede hacer que sea difícil alcanzar las concentraciones terapéuticas antes de la terminación de la experimentación y / o evitar la acumulación de suficientes puntos de datos de imágenes de bioluminiscencia en el curso de los experimentos. Un curso de tiempo de más de 60 días realiza el ajuste de parámetros experimentales difíciles de manejar y prolonga innecesariamente la duración de los experimentos previstos.

Por último, también quisiera señalar que hemos utilizado esta metodología ortotópico xenoinjertos con ST88-14 células injertadas en ratones NIH III para demostrar la eficacia terapéutica de tamoxifeno ^6. Una descripción detallada de los métodos que utilizan habitualmente para evaluar los efectos de posibles agentes terapéuticos en xenoinjertos ortotópico se pueden encontrar en el manuscrito. También se ha demostrado que las células neurofibroma puede ser injertadas con éxito en los nervios periféricos ^12, lo que sugiere que, con modificaciones, los procedimientos descritos en este protocolo se puede utilizar para realizar los ensayos preclínicos con posibles agentes terapéuticos dirigidos contra la neurofibromas.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Foxchase outbred SCID mice	Charles River Laboratories	#236
NIH III mice	Taconic	#NIHBNX
NOD-SCIDγ mice	Jackson Laboratory	#005557
Cell Stripper	Fisher Scientific	25-056-cl
Vetbond surgical glue	3M	1469SB
Hamilton syringe	Hamilton Co	#80030	10 μL volume
Hamilton syringe needles	Hamilton Co	#7803-05	33 Ga., 0.5 inch, PT4 (custom made)
Ear tags	National Band and Ear Tag Co.	1005-1
Ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38