İnsan Takip edilen-Lusiferaz Malign Periferik Sinir Kılıf Tümör Hücreleri Ortotopik Xenografting In vivo Test

Özet

Lusiferaz etiketli insan malign periferik sinir kılıfı tümör hücreleri, bağışık yetmezliği olan farelere siyatik sinir grefti için güvenilir bir yöntem açıklanmıştır. Biyoparlaklık görüntüleme, çalışma grupları içine hayvanların rastgele ayrımı için tümör greft ve kriterlere uygun kurulmasını göstermek için kullanımı da tartışılmıştır.

Özet

In vitro ekranlarında aday terapötik ajanların ilk tanımlanması, ilaç, tümör büyümesini uygun bir hayvan modeli yapılmalıdır inhibe ettiği yeteneği titiz bir değerlendirme için gerekli olmasına rağmen . Bu amaç için en iyi hayvan modeli türü yoğun bir tartışma konusu. Bazı kanıtlar, transgenik farelerde ortaya çıkan tümörler ilaç etkilerini inceleyen klinik öncesi ^denemeler, klinik sonuç 1 daha öngörü ve bu yüzden aday terapötik ajanlar genellikle bu modellerin test gösterir. Ne yazık ki, transgenik modelleri birçok tümör türleri için mevcut değildir. Ayrıca, transgenik modeller genellikle insan meslektaşı tümör fenotip ve bir yetersizlik eksik penetrans tümörleri geliştirmek ne zaman ne kadar iyi tahmin etmek için fare tümör modelleri gibi endişeleri gibi diğer sınırlamaları vardır.

Sonuç olarak, uygun transgenik tümör modellerinde mevcut değilse, birçok araştırmacı preklinik çalışmalar için xenograft modelleri (bağışık yetmezliği olan farelere insan tümör hücreleri içine aşılı) kullanın. Ikincisi tedavi aralıkları hızlı belirlenmesi kolaylaştırmak, transgenik modeller mevcuttur bile genellikle xenograft modelleri ile ortaklığa vardır. Ayrıca, bu ortaklık, transgenik tümörler ve hakiki insan tümör hücreleri ajanın etkinliğinin bir karşılaştırma sağlar. Tarihsel olarak, sıklıkla subkutan tümör hücreleri enjekte (ektopik xenografts) tarafından gerçekleştirilir olmuştur xenografting. Bu teknik, hızlı ve nispeten ucuz, tekrarlanabilir ve tedavi süresi ² sırasında, tümör büyümesini sürekli kantitatif sağlar . Ancak, subkutan alan ektopik xenografting ile elde edilen en neoplazmlar ve bu yüzden sonuç için normal mikroçevresinin değildir konak doku ve tümör genlerin organ-spesifik bir ifade olmaması gibi faktörler nedeniyle yanıltıcı olabilir. Bu nedenle ektopik aşılama çalışmaları insan tümör hücreleri geldikleri doku (ortotopik xenografting) ² aşılı olduğu çalışmalar tarafından değiştirilmesi veya tamamlanabilir tavsiye edilmiştir. Ne yazık ki, bu tavsiyenin uygulanması genellikle ortotopik xenografting metodolojileri henüz birçok tümör tipleri için geliştirilmiştir olduğu gerçeği ile bertaraf.

Malign periferik sinir kılıfı tümörleri (MPNSTs) Nörofibromatozis tip 1 ³ ve ⁴ siyatik sinir en sık ortaya çıkan sporadik veya dernek meydana gelen son derece agresif sarkomlar . Burada ateşböceği lusiferaz etiketli insan MPNST hücreler orthopically bağışık yetmezliği olan farelere siyatik sinir xenografted hangi bir teknik olarak basit bir yöntem tarif. Bireysel hayvanlar ve çalışma grupları içine sonraki olmayan önyargılı randomizasyon aşılama işlemi başarı değerlendirilmesi Bizim yaklaşımımız da tartışılır.

Protokol

1. Sigara çıplak bağışık yetmezliği olan farelere (Nude Suşlarının için gerekli değildir) ilk Hazırlanışı:

1. Tüm işlemler önceden gözden geçirilmiş ve onaylanmış UAB Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından uygun şekilde eğitilmiş personel tarafından yürütülmektedir. Biz bu deneyler için bağışık yetmezliği olan farelere üç tür başarıyla kullanılır: a) Foxchase SCID fareleri outbred (CB17/lcr- Prkdc ^SCID / lcrCrl fareler), b) NIH III fareler (NIHS LYST ^bg Foxn1 ^nu Brk ^xid fareler) ve c ) NOD-SCIDγ fareler (NOD.Cg Prkdc ^SCID Il2rg ^tm1Wjl / SzJ fareler). Bizim ellerde, ortotopik xenografts büyüme, her ikisi de T hücreleri, B hücreleri ve NK hücre fonksiyonunu etkileyen mutasyonlar taşıyan NIH III ve NOD-SCIDγ fareler, hemen hemen aynıdır; bu protokol için, greft için gerekli gün sayısı büyüme, tedaviye başlanması ve görüntüleme yapıldığında kez sonrası aşılama olduğu zaman NOD-SCIDγ fareler kullanılarak ampirik olarak tespit ettik. Foxchase içinde Greft büyüme, T-ve B-hücre fonksiyonu hatalarına SCID fareleri outbred, genellikle daha uzun sürer.
2. Olmayan çıplak bağışık yetmezliği olan farelere çok sayıda grefti kolaylaştırmak için, önce aşılama öğleden sonra cerrahi sitesinden saç kaldırmak. Fare anestezi kullanılarak, atık gaz geçinmek buharlaştırıcı bağlı bir izofluran indüksiyon odası. Vücut ısısını korumak için, hayvanların bu süreçte bir ısıtma yastığı işlenir. Clippers, orta geri aşılı olmaktır tarafında arka bacak diz saç kaldırmak için kullanılır. Kalan saç ~ 5 dakika, bir kimyasal tüy dökücü ajan (örneğin Nair, aloe vera, hassas ciltler için özellikle bir ürün) kullanarak site dikkatlice çıkarılır. , Deri, göz ve diğer vücut yüzeyleri yayılabilir tahrişine yol açabilir olarak tüy dökücü ürün kaldırılması tavsiye edilir. Çalışma grupları farelerin kaybı sonucu, bu kadar bu deneyler hem de siyatik sinirleri bilateral hindleg fonksiyonunu bozabilir greft yok.
3. Fare yataklar olmayan bir izolasyon kafes içinde bir ısıtma yastığı tamamen kurtarmak için izin verilir, bu fareler, daha uyanık, diğer hayvanlar tarafından yaralanan olmadığını sağlar ve yanlışlıkla yataklar teneffüs engeller hem de. Fareler tamamen mobil ve sarhoşluk hiçbir kanıt göstermek, diğer farelerin bir kafes içine tekrar edilebilir.

2. Aşılama Günü Enjeksiyon için MPNST Hücreler hazırlanması

1. Biz ampirik ST88-14 hücreleri, yaygın olarak kullanılan bir NF1 ile ilişkili tümör ⁵ türetilen bir MPNST hattı için belirlenmiş olan bu protokol sonrası aşılama, hücrelerin belirli bir sayıya aşılı ve tümör büyümesi için gereklidir. Aşılama için kullandığımız hücreleri stably biyoparlaklık görüntüleme ⁶ tarafından belirlenen ateşböceği lusiferaz ifade CMV lusiferaz IRES puromycin kaset ve klonlar içeren bir lentiviral vektör transduced olmuştur. Biz stably CMV hemen erken organizatörü kontrolü altında ateşböceği lusiferaz ifade plazmid ile transfekte MPNST hücreleri ile aşılama deneyler gerçekleştirdik. Bu plazmid vektörler ifade aşağıdaki aşılama yok tabi eğilimli olduğunu bulduk Biz bu tavsiye etmiyoruz.
2. ST88-14 hücreleri% 10 fetal buzağı serumu, 10 mcg / ml streptomisin ve 10 IU / ml penisilin (DMEM10) ile desteklenen Dulbecco'nun asgari temel orta yetiştirilen vardır; 5 mg / ml puromycin da lentiviral vektör için seçim korumak için dahil edilir. Biz 50 pasajlar, bu hücrelerin laboratuvarda korumuştur ve hücre büyümesini Bu bölümlerin herhangi birinde herhangi bir değişiklik gözlenmez. 9 x 10 ⁵ ST88-14 hücreleri, T175 balon balon yaklaşık% 80 konfluent hangi noktada kaplama ve 3 gün için yetiştirilir. Greft 35 fareler için% 80, tek bir konfluent T175 şişesi gereklidir; bu yoğunluk, ST88-14 hücreleri için ortalama verim T175 şişesi ortalama 7.3 x 10 ⁶ hücre. Bu hücreler, aşılama için hasat öncesinde izdiham büyümeye izin verilmez ki büyük önem taşımaktadır. Biz aşılama hücre greft yetmezliği daha yüksek bir derecede konfluent şişeler sonuçları hasat ve sıklıkla greft büyüme in vivo kursu uzatır bulduk.
3. ST88-14 hücreleri oda sıcaklığında Hanks 'dengeli tuz solüsyonu ile bir kez durulanır. Hücreler Hücre Stripper hücre disosiasyon çözüm oda sıcaklığında 30 saniye ile 1 dakika kullanarak şişeyi kaldırılır. DMEM10, beş mililitre (Not: puromycin bu ortamda dahil değildir) kullanılan Cell Stripper her mililitrede hücrelere sonra eklenir.
4. Hücreler hemasitometre kullanarak sayılır. 3 mcL asılı 5 x 10 ³ ST88-14 hücreleri, fare başına düşen enjekte edilecektir . Pipetleme için ödenek ile tüm kohort greft yeterli hücreleri, bir miktarhata (örneğin, 35 fareler için, biz genellikle yeterli hücre greft 40 fareler için bir dizi transfer), 1,5 mL steril bir tüpe aktarılır. Hücreler 3000 rpm'de 5 dakika santrifüj edilir. Süpernatant dikkatlice çıkarılır ve hücre pelletini DMEM10 yeniden süspanse (Not: Bu ortamda puromycin dahil değildir) 3 mcL başına 5 x 10 ³ hücre nihai konsantrasyonu. Buz hücrelerinin tutun.

3. Protokol Aşılama

1. Artık bir ayak tutam uyaran hindlimb çekilmeye kadar Fareler izofluran vaporizatör indüksiyon odasında anestezi. Fare onların tarafında yer ve 0.05 mg / kg buprenorfin hydrocholoride ile subkutan enjekte edilir. Anestezi sonra burun konisi ile teslim izofluran sürekli yönetim ile korunur. Ötenazi fareler video için bu yordamı göstermek için kullanılabilir olduğunu unutmayın; dolayısıyla, izofluran teslim etmek için kullanılan izofluran boru video görünmez.
2. Vücut ısısını korumak için, hayvanların aşılama süreci boyunca bir ısıtma yastığı işlenir. (Puralube veteriner merhem) kornea kuruma, oftalmik merhem küçük bir damla önlemek için her bir göz için uygulanır. , Yargılama boyunca, benzersiz tespit edilmesi her bir fare için gerekli olacak gibi, benzersiz bir tanımlayıcı numarası ile bir kulak etiketi her bir farenin sağ kulak kırpılır.
3. Mide üzerine yerleştirin, hayvan, arka ayakları yaymak. Meydana gelecektir grefti cerrahi penceresi (böğür) açığa, steril bir drape fare ile kaplayın. Steril örtüyü başının görselleştirme izin vermeli, hem de burun konisi içinde olduğundan emin olmak için ve solunum ve hayvan renk izlenmesine olanak. Kanadını merkezinde başlayan ve yavaş yavaş cerrahi pencere kenarları dışa doğru helezonik bir pamuk uçlu bir aplikatör, cerrahi bölge betadin uygulayın. % 70 etanol, sonra aynı şekilde cerrahi site uygulanır. Ardışık uygulamalar etanol ile takip betadin iki defa daha tekrarlanır.
4. Çıkarın ve buz ya da hafifçe vorteks hücreleri veya tüp yerleşmiş hücreleri tekrar süspansiyon hareketiyle. Bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonu 3.2 mcL kaldırmak ve Parafilm bir parça üzerine çıkarmak. Gerekenden daha kaldırarak ve Parafilm süspansiyon yerleştirerek, süspansiyon kabarcıklar olduğunu sağlamak ve enjeksiyon için tam 3 mcL var. 33 gauge iğne ile donatılmış bir 10 mcL Hamilton şırınga içine kadar hücre süspansiyonu mümkün çekin. Flick şırıngaya kabarcıkları ve tam olarak 3 mcL aşırı hücre süspansiyonu sınırdışı. Buz üzerinde hücre ve hücre içeren şırınga, iğne steril kalmasını sağlamak için, buz veya kova ile temasa izin verilmez; kullanmak için hazır olana kadar tutun. Saran wrap bir parça buz doğrudan temas şırıngaya buz üstüne yerleştirilebilir.
5. No 22 neşter bıçağı ile donatılmıştır No 4 neşter kolu kullanarak, sadece aşağıdaki paralel femur kanadını cilt üzerinden bir kesi yapmak; kesi ameliyatla temizlendi alan sınırları ötesine olmadığından emin olun. Altta yatan kas maruz elle cerrahi kelepçe veya cilt insizyonu ile açın. Fasyal düzlemde bacak uzunluğu boyunca çalışan görülebilir, siyatik sinir altında ve fasya ile bağlı iki kaslar arasındaki yatıyor. Bir çift sivri uçlu bir makas kullanarak, künt, siyatik sinir, kalın bir iplik kalınlığı beyaz bir doğrusal bir yapı olarak görünür olmalıdır maruz fasya yoluyla teşrih.
6. Bir çift sivri uçlu kavisli bir forseps kullanarak, dikkatli bir şekilde altta yatan kas gevşeme, sinir altında teşrih; yükseltir ve sinir izole hem de. Bu konumu korumak için sinir altında forseps bırakın. Hamilton şırınga, iğne, sinir içine iğne sinirin alt yoluyla ponksiyon değildir, mümkün olduğu kadar sinir paralel olarak enjeksiyon açısını korumak için çalışıyoruz dikkatlice yerleştirin. İğne distal sinir sonuna doğru takılmalıdır omurga-omurilik doğru sinir içine tümör hücrelerinin enjeksiyonu aşılı tümör hücrelerinin omuriliğe yakın bir yakınlık kurar bulduk. Bu durumda, tümör hücrelerinin genellikle spinal kord fonksiyonu ele geçirmesine bağlı çalışma grubu hayvan erken kaybı sonucu, omurilik işgal.
7. Iğne sinir doğru konumlandırılmış sonra, dinlenmek ve forseps ile sinir üretilen gerilim yavaş yavaş 45-60 saniye içinde sinir hücreleri şırınga ile enjekte. Bu hızla şırınga içeriğini sürülmesi, enjeksiyon yeri ve onların kaybı çevresinde tümör hücreleri bir "geri yıkama" neden olacağı için, bu yavaş yavaş yapılabilir esastır. Tüm hücreleri başarıyla enjekte edildikten sonra, yavaş yavaş enjekte malzeme kaybı en aza indirmek için iğneyi çıkartın.
8. Için KaldırCEPS ve dikkatle kas altında orijinal konuma geri sinir yerleştirin. Cerrahi kesi Vetbond cerrahi yapıştırıcı ile kapatın. Tutkal kuruması için yaklaşık 20 saniye boyunca forseps ile birlikte kesi tutun.
9. Fare, burun konisi izofluran kaldırılır ve, kurtarmak için bir çarşaf kafeste tek başına yerleştirilir. Bu kafes, hayvan tamamen iyileşene kadar bir ısıtma yastığı üstünde tutulmalıdır. Bir ısıtma yastığı kurtarma kafesin parçası olmamalı, bu çok sıcak olsun, hayvan ısı uzaklaşmaya sağlar. Aşılama sonrasında, hayvanlar, site, topallık veya anoreksi çiğneme için düzenli olarak değerlendirilebilir; bu işaretler hayvan hala ağrı ve o uygun analjezikler verilmelidir göstergesi olabilir. Bu yordamı ile deneyim kazandıktan sonra, biz 30-40 farelerin kolayca tek bir gün içinde aşılı olabilir bulduk.

4. Çalışma Grupları Greft Başarı ve Randomizasyon Into Değerlendirilmesi

1. Biyoparlaklık görüntüleme aşılama işlemi başarı değerlendirmek için kullanılır. Biz substrat, D-luciferase lusiferaz kimyasal reaksiyonun bir sonucu olarak üretilen tümör ifade ateşböceği lusiferaz ışık emisyon algılamak için bir IVIS-100 sistemi (aslen Xenogen, şimdi Kumpaslar A.Ş. olarak bilinir) . Bu görüntülerin analizi, özel aşılı farelerin terapötik deneme kohortlarında girmesi için uygun olup olmadığını belirler. Ön deneylerde, tümörler ve üreticinin Living Görüntü Yazılımı kullanarak faiz analizler bölgeden biyoparlaklık sinyalleri ile ilişkili tümör ağırlıklar hasat biyoparlaklık saptanabilir sinyalleri, kurban aşılı farelerin, sayısal var. Bu çalışmalar biyoparlaklık görüntüleme preklinik çalışmaların seyri boyunca xenograftlarının büyüme değerlendirmek uygun bir vekil anlamına gelir gösteren tümör greft ağırlıkları ve bioluminesans ışık yayma arasında doğrusal bir korelasyon olduğunu göstermiştir. Genellikle, aynı zamanda görüntü 5 fareler. Biyoparlaklık görüntüleme hakkında ek ayrıntılar daha ^önce 7 yayımlandı .
2. Greft başarısını değerlendirmek için, biyoparlaklık görüntüleme 1 yapılır ve 3 gün sonrası aşılama. Görüntüler 2,5 mg D-luciferase intraperitoneal sonra aynı pozisyonda 10 dakika odaklı farelerde toplanır. Görüntüleme sırasında, fare, Xenogen görüntüleyici bir ısıtma yastığı ile 37 ° C'de muhafaza izofluran anestezi ve vücut ısısı altında tutulur. Görüntü elde etme süreleri 2 saniye ile 10 dakika aralığında; veri toplama yazılımı hiçbir piksel görüntü toplama sırasında doymuş olduğunu sigortalanır. Tümör bölgelerinde (göreceli foton sayısı / sn) Işık emisyon Xenogen tescilli yazılım kullanarak ölçülür. Işık emisyon yoğunluğu, aynı zamanda toplanan farelerin siyah ve beyaz fotoğraflar üzerine yerleştirilmiştir biyoparlaklık Pseudocolor ölçekleme tarafından temsil edilmektedir.
3. Preklinik bir deneme kohort dahil alabilmek için, fare, hem de 1 ve 3 sonrası aşılama gün ve biyoparlaklık sinyal yoğunluğu gün 1 ile 3 arasında artış saptanabilir biyoparlaklık sinyal sahip olması gerekir. Bir azalma ya da statik sinyal Hayvanlar dışındadır. Buna ek olarak, aynı gün aşılanmış farelerde tespit sinyalleri birbirlerine büyüklüğü 1 düzen içinde olmalıdır, düşük veya aynı gün aşılı hayvanların tespit edilen daha yüksek büyüklükte bir sipariş biyoparlaklık sinyalleri ile farelerde de dışlanır.
4. Bir kez fareler, bu kriterleri yerine tedavi gruba randomize gerektiği tespit edilmiştir. Bunu başarmak için, aşılı farelerin tespit lusiferaz sinyalleri sonrası aşılama 3 gün önce yüksekten en düşük yoğunluk sıralanıyor;. Fare sonra, tedavi gruplarına yoğunluk sırasına göre atanarak, bu sırada geri ve daha sonra tüm fareler gruplara atanır kadar işlemi tekrarlayarak gruba randomize. Örneğin, 1, 2, 3, 4, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4 tedavi grupları (örneğin, plasebo ve test ilacın üç konsantrasyonları) farelerde varsa gruplarına atanır , 4, 4, 3, 2, 1 .. vs. Tedaviye başlamadan önce, atanan grubun her bir üyesi tespit biyoparlaklık sinyalleri tüm gruplar içinde ortalama başlangıç ​​sinyalleri mümkün olduğunca yakın olduğundan emin olmak için ortalaması alınır. Aday terapötik ajan İdaresi 3 gün başladı.
5. Terapötik ajan tedavi seyri sırasında greft büyüme üzerindeki etkisini değerlendirmek için, biyoparlaklık görüntüleme başında tedavi bir hafta sonra (10, 17, 24, 30 sonrası aşılama) bir kez yapılır. Olmayan çıplak bağışık yetmezliği olan farelere için, bu hayvanları tekrar her görüntüleme oturumu gerçekleştirmeden önce Nair ile kaldırıldı yeni kürk büyüme olduğunu büyük önem taşımaktadır. Bunun nedeni, sinyal ne kadar kayıp belirleyen kat renk saç blokları bioluminescent sinyalleri. Örneğin, Swiss W gibi beyaz kürk bulundusiyah kürk gibi çok ⁹ 10 kat olarak sinyalleri azaltabilir ebster fareler, bioluminescent sinyal yoğunluğu ^8% 18 azalma sağlamaktadır. Ayrıca düzgün kürk regrowth tüm tedavi grupları ve tedavi grupları arasında "normalleştirme" sinyali azalmalar meydana gelecektir farz olamaz dikkat cekti. Terapötik ajan kendisi saç gelişimini etkileyebilir, çünkü bu. Örneğin, tamoksifen, tedavi, plasebo ile tedavi edilen farelerde ile kıyaslandığında tümör büyümesi üzerine, bu ajanın algılanan etkiyi en aza indirmek ve böylece saç regrowth inhibe ettiğini kaydetti var.
6. ST88-14 MPNST hücreleri, fare, 30 gün sonrası aşılama yapılabilir. Bu zamanda, tümörler genellikle kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komiteleri tarafından izin verilen maksimum boyutu büyüdü ve kurban gerekir. Son görüntüleme oturumun ardından, fareleri tedavi sonuçlarını (örneğin, terapötik ajan, ağırlık tayini için tümör dokusu, histoloji incelenmesi, Ki67 belirlenmesi ve TUNEL etiketleme endeksleri dolaşımdaki düzeylerinin belirlenmesi için kan ve daha fazla analiz için öldürüldü ve numuneler gerekli biyokimyasal parametrelerin değerlendirilmesi) toplanır. Kesinlikle ne deneysel tasarım örneği toplandı ihtiyaçlarına bağlı olacaktır.
7. Tümörlü fareler (eksikliği de normal bakım ve kaçınma davranışları) hasta olduğunda, günlük olarak takip ve sona erdirilebilir, yemek ya da içmek mümkün değildir, ya da tümör aşırı büyük olur gibi normal vücut hareketini engellemek için. Tümör yükü hayvanın normal vücut ağırlığının% 10'unu izin verilmemelidir. Vücut ağırlığının yüzdesi olarak tümör ağırlığı, yaş / cinsiyet eşleştirilmiş kontrol hayvanların kilo tümör taşıyan hayvanların ağırlığı karşılaştırılarak hesaplanır. Kaşeksi, klinik olarak anlamlı haline gelmesine izin verilmemelidir. Tümör taşıyan hayvanlarda kilo kaybı, normal vücut ağırlığının% 20 geçmemelidir.

5. Temsilcisi Sonuçlar:

Şekil 1 gözlenen biyoparlaklık tipik progresif olarak artış göstermektedir 1 ila 18 gün sonrası aşılama çıplak (NIH III) fare (AC) düzgün kurulmuş ortotopik xenograft. Biyoparlaklık sinyalleri sayısal bu sinyaller giderek artıyor olsa da, tümör büyümesini, belirgin bir şekilde çalışma süresi (Şekil 1D) daha sonraki aşamalarında hızlandırır gösterir aşılama 1-24 gün sonra gözlemledi. Titizlikle aşılanmış farelerde tümör büyümesini oluştu göstermek için, rutin olarak tümör epineurium rüptüre ve çevresindeki yumuşak doku ve iskelet kası, komşu doku işgal belirirse, siyatik sinir toplamak ve. MPNSTs agresif büyüme dikkate alındığında, biz sık sık aşılı tümör hücrelerinin sinir normal bariyerleri delinebilir ve komşu dokulara (Şekil 1E) işgal olduğunu bulmak şaşırtıcı değildir. Biz de sık sık bu aşılı MPNST proksimal ve greft distalinde sinir hücreleri agresif göç bulabilirsiniz.

Şekil 1 NIH III fare Biyoparlaklık görüntüleme orthotopically 1 gün sonrası aşılama lusiferaz etiketli MPNST hücreleri ile aşılı (A). Ilgi bölgesi (ROI) içinde farklı farelerde tespit edilen sinyaller birbirinden büyüklükte bir düzen içinde olduğunu unutmayın. Reimaging 10 gün (B) ve (C) 18 gün bireysel farelerde greft yerinde bioluminescent sinyalleri giderek arttığını göstermektedir sonrası aşılama. (D) Grafik-greftleme sonrası 1-24 gün greft sitesi üzerinden tespit edilen göreli sayıları foton / saniye ilerici artış gösteren. (E) Bu fare greft sitenin yüzey elde tümör büyümesi ve komşu iskelet kas içine odak işgali göstermektedir.

Tartışmalar

Burada sunulan ayrıntılı ortotopik xenografting yöntemi ST88-14 MPNST hücreleri kullanarak, bu NF1 ile ilişkili periferik sinir kılıfı tümörlerinin çalışmalarda yaygın olarak kullanılan bir çizgi geliştirdi. Ancak, bu yöntemi diğer MPNST hücre hatları ile preklinik çalışmalar için kolayca uyarlanabilir. Örneğin, biz de ST88 gözlenen benzer başarı ile STS-26T ¹⁰ hücreleri, NF1 ile ilişkili MPNST türetilmiş bir sporadik olarak ortaya çıkan MPNST ve T265-2c ¹¹ hücreleri, türetilmiş bir çizgi ile xenografting ortotopik gerçekleştirdik -14 hücreleri.

, Diğer MPNST hatların aşılama için biz burada açıklamak ST88-14 hücreleri xenografting ortotopik için tam koşulları doğrudan kabul edilmesi dikkat edeceğini söyledi olması. Bunun yerine, metodoloji temel parametreleri deneysel olarak her hücre hattı için tespit edilmelidir. Bu parametreler, başlangıçta aşılı MPNST hücrelerinin sayısı, bir dereceye kadar greft geliştirme ve izin süresi, ses tümör hücreleri enjekte edilir. Yeni bir satır için bu parametreleri kurmak için, biz büyüklük her sipariş (yani, 10, 5 x ³ hücre greft grupları, 10 ³ 5 x 10 ⁶ tümör hücrelerinin (her grupta 5 fare) ile farelerde hücre konsantrasyonları kontrol 10 ³ hücre, 10 ⁴ hücreler, 5 x 10 ⁴ hücreleri, vb.) Tümör hücreleri (> 10 ⁶⁾ Büyük sayılar daha büyük bir hacim enjekte edilmelidir; 5 ml kadar aşılı sinir hücrelerinin kaybı olmadan enjekte edilebilir olduğunu bulduk. Ayrıca yoğun süspansiyonlar tümör hücrelerini öldürür kesme giderek daha eğilimli olarak 5 ml hacim başına en fazla 5 x 10 ⁶ tümör hücreleri enjekte edilebilir olduğunu bulduk. , Her grup içinde en az üç hayvan, biz de o grubun feshedebilir ve bu noktada greft büyüme onaylamak için histolojik sinir incelemek palpabl tümörler, kadar bu farelerin izleyin. Genel olarak, biz, 30-60 gün içinde maksimum izin verilen tümör büyümesini ulaşacaktır hücrelerinin bir konsantrasyon arıyorlar; Açıkçası, enjekte edilen hücrelerin sayısına bağlı olarak, bu noktada farklı olacaktır ulaşmak için gerekli. Zor deney ve / sona ermesinden önce etkin terapötik konsantrasyonlarda ulaşmak ya da deneyler boyunca yeterli biyoparlaklık görüntüleme datapoints birikmesini önlemek için daha hızlı büyüme yapabilirsiniz. 60 günden daha uzun bir zaman ders deneysel parametreleri ayarlayarak hantal yapar ve gereksiz planlanan deneyler süresini uzatır.

Son olarak, biz de ^tamoksifen 6 terapötik etkinliğini göstermek için, NIH III farelere aşılı ST88-14 hücreleri ile bu ortotopik xenografting metodoloji olduğuna dikkat edin. Biz rutin ortotopik xenografts aday terapötik ajanların etkilerini değerlendirmek için kullandıkları yöntemleri ayrıntılı bir açıklama bu yazının bulunabilir. Ayrıca nörofibroma hücreleri başarıyla değişiklikler ile, bu protokolde belirtilen usul nörofibromlar karşı yönettiği aday terapötik ajanlar ile klinik öncesi denemeler yapmak için kullanılan, ¹² periferik sinir içine aşılı olduğunu kanıtlanmıştır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Foxchase outbred SCID mice	Charles River Laboratories	#236
NIH III mice	Taconic	#NIHBNX
NOD-SCIDγ mice	Jackson Laboratory	#005557
Cell Stripper	Fisher Scientific	25-056-cl
Vetbond surgical glue	3M	1469SB
Hamilton syringe	Hamilton Co	#80030	10 μL volume
Hamilton syringe needles	Hamilton Co	#7803-05	33 Ga., 0.5 inch, PT4 (custom made)
Ear tags	National Band and Ear Tag Co.	1005-1
Ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38