Xenotrapianto ortotopico di Human-luciferasi con tag cellule maligne del tumore della guaina dei nervi periferici per In vivo Test di agenti terapeutici candidati

Riepilogo

Un metodo affidabile per l'innesto luciferasi-tagged umani maligni dei nervi periferici cellule tumorali della guaina nel nervo sciatico di topi immunodeficienti è descritto. L'uso di immagini bioluminescenza per dimostrare corretta predisposizione degli innesti del tumore ed i criteri per la segregazione casuale di animali in gruppi di studio vengono anche discussi.

Abstract

Sebbene in vitro schermi sono essenziali per l'identificazione iniziale di agenti terapeutici candidato, una rigorosa valutazione della capacità del farmaco di inibire la crescita tumorale deve essere eseguito in un modello animale adeguato. Il tipo di modello animale che è meglio per questo scopo è un argomento di discussione intensa. Alcune evidenze indicano che gli studi preclinici hanno esaminato gli effetti della droga sui tumori che insorgono in topi transgenici sono più predittivi di outcome clinico ¹ e così gli agenti candidato terapeutici sono spesso testati in questi modelli. Purtroppo, i modelli transgenici non sono disponibili per molti tipi di tumore. Inoltre, i modelli transgenici hanno spesso altre limitazioni come ad esempio le preoccupazioni su come anche i modelli del mouse tumore sua controparte umana, penetranza incompleta del fenotipo tumorale e l'incapacità di prevedere quando i tumori si sviluppano.

Di conseguenza, molti ricercatori utilizzano modelli di xenotrapianto (innestato cellule tumorali umane in topi immunodeficienti) per gli studi preclinici, se del caso modelli tumorali transgenici non sono disponibili. Anche se i modelli transgenici sono disponibili, sono spesso in partnership con modelli di xenotrapianto di questi ultimi facilitare la determinazione rapida degli intervalli terapeutici. Inoltre, questa partnership permette un confronto tra l'efficacia del farmaco in tumori transgenici e genuini cellule tumorali umane. Storicamente, xenotrapianto è stata spesso eseguita iniettando cellule tumorali per via sottocutanea (xenotrapianti ectopica). Questa tecnica è rapida e riproducibile, poco costoso e permette quantificazione continuo di crescita del tumore durante il periodo terapeutico ^2. Tuttavia, lo spazio sottocutaneo non è il microambiente normale per la maggior parte neoplasie e quindi i risultati ottenuti con xenotrapianto ectopica può essere fuorviante a causa di fattori quali l'assenza di organo-specifica espressione del tessuto ospite e geni del tumore. E 'stato pertanto fortemente raccomandato che ectopica studi innesto essere sostituiti o integrati da studi in cui si innestano le cellule tumorali umane nel loro tessuto di origine (xenotrapianto ortotopico) ^2. Purtroppo, l'attuazione di questa raccomandazione è spesso ostacolato dal fatto che ortotopico metodologie xenotrapianto non sono ancora stati sviluppati per molti tipi di tumore.

I tumori maligni della guaina dei nervi periferici (MPNSTs) sono sarcomi molto aggressivi che si verificano sporadicamente o in associazione con neurofibromatosi di tipo 1 ³ e più comunemente sorgono nel nervo sciatico ^4. Qui si descrive un metodo tecnicamente semplice, in cui lucciola luciferasi-tagged MPNST cellule umane sono orthopically trapiantate nel nervo sciatico di topi immunodeficienti. Il nostro approccio per valutare il successo della procedura di trapianto nei singoli animali e la successiva randomizzazione non polarizzato in gruppi di studio è anche discusso.

Protocollo

1. La preparazione iniziale di topi immunodeficienti non nude (non necessario per Ceppi Nudità):

1. Tutte le procedure sono stati esaminati e approvati preventivamente dal UAB Cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa e condotto da personale adeguatamente addestrato. Abbiamo utilizzato con successo tre ceppi di topi immunodeficienti per questi esperimenti: a) Foxchase outbred topi SCID (CB17/lcr- Prkdc ^scid / lcrCrl topi), b) NIH III topi (NIHS-LYST ^bg Foxn1 ^nu Brk topi ^xid) e c )-SCIDγ topi NOD (NOD.Cg-Prkdc ^scid Il2rg ^tm1Wjl / SzJ topi). Nelle nostre mani, la crescita di xenotrapianti ortotopico è praticamente identico a NIH III e NOD-SCIDγ topi, entrambi portatori di mutazioni che interessano la funzione delle cellule T, cellule B e le cellule NK, per questo protocollo, il numero di giorni necessari per l'innesto la crescita, il momento in cui è iniziato la terapia ed i tempi di post-trapianto viene effettuato quando l'imaging sono quelli che abbiamo empiricamente determinato utilizzando topi NOD-SCIDγ. Crescita del trapianto in Foxchase outbred topi SCID, che hanno difetti di T e B, funzione delle cellule, in genere dura più a lungo.
2. Per facilitare l'innesto di un gran numero di topi immunodeficienti non nudo, togliamo i capelli dal sito chirurgico nel pomeriggio prima del trapianto. I topi vengono anestetizzati con una camera isoflurano induzione collegato a un vaporizzatore per pulire con il gas di scarico. Per mantenere la temperatura corporea, gli animali vengono trattati su una piastra elettrica in tutto questo processo. Clippers sono utilizzati per eliminare i peli dalla metà-back fino al ginocchio della gamba posteriore sul lato che deve essere innestato. Tutti i capelli rimanenti viene accuratamente rimosso dal sito in ~ 5 minuti con un agente chimico depilatorio (ad esempio Nair, in particolare un prodotto con aloe vera per la pelle sensibile). La rimozione del prodotto depilatoria è raccomandato in quanto può causare irritazioni della pelle, degli occhi, e le superfici di altri enti ai quali potrebbe diffondersi. Non innesto entrambi i nervi sciatico in questi esperimenti in quanto ciò potrebbe compromettere la funzione gamba posteriore bilateralmente, con la conseguente perdita di topi da parte dei gruppi di studio.
3. I topi sono autorizzati a recuperare completamente su una piastra elettrica in una gabbia di isolamento senza biancheria da letto; questo sia assicura che i topi non sono feriti da altri animali più pienamente vigile e impedisce loro di inalazione accidentale biancheria da letto. Quando i topi sono completamente mobili e non mostrano segni di stordimento, possono essere reintrodotti in una gabbia con altri topi.

2. Preparazione di cellule MPNST per iniezione nel Giorno del innesto

1. In questo protocollo, il numero di cellule innestate e dei tempi necessari per la crescita tumorale post-trapianto sono quelli che abbiamo empiricamente determinato per ST88-14 cellule, una linea di uso comune MPNST che era derivato da un NF1 associate tumore ^5. Le cellule che usiamo per l'innesto sono state trasdotte con un vettore lentivirale contenente una CMV luciferasi-IRES-puromicina cassetta e cloni che esprimono stabilmente luciferasi lucciola identificato da bioluminescenza immagini ^6. Abbiamo anche eseguito l'innesto esperimenti con le cellule MPNST stabilmente transfettate con plasmidi che esprimono lucciola luciferasi sotto il controllo del promotore CMV immediato presto. Non è consigliabile questo che abbiamo trovato che questi vettori plasmidici sono inclini a sottoporsi estinzione di espressione seguente innesto.
2. ST88-14 le cellule sono coltivate in terreno minimo indispensabile Dulbecco integrato con siero di vitello al 10% del feto, 10 mg / ml streptomicina e 10 IU / ml penicillina (DMEM10); 5 mcg / ml puromicina è incluso anche per mantenere la selezione per i vettori lentivirali. Abbiamo mantenuto queste cellule nel nostro laboratorio per 50 passaggi e non hanno osservato variazioni nella crescita cellulare in qualsiasi di questi passaggi. 9 x 10 ⁵ ST88-14 cellule sono placcati in un pallone T175 e cresciuto per 3 giorni, momento in cui il pallone è di circa l'80% confluenti. Per innesto 35 topi, un singolo 80% confluenti T175 pallone viene richiesto; a questa densità, il nostro rendimento medio per ST88-14 cellule è 7,3 x 10 ⁶ cellule per T175 pallone. E 'estremamente importante che le cellule non essere permesso di crescere fino a confluenza prima della raccolta per l'innesto. Abbiamo scoperto che le cellule raccolte da innesto confluenti risultati fiaschi in un grado più elevato di fallimento del trapianto e prolunga spesso in corso vivo della crescita del trapianto.
3. ST88-14 cellule, una volta sciacquate con una soluzione salina bilanciata a temperatura ambiente Hanks '. Le cellule vengono rimosse dal pallone con Stripper cella cella di dissociazione soluzione per 30 secondi a 1 minuto a temperatura ambiente. Cinque millilitri di DMEM10 (Nota: puromicina non è incluso in questo mezzo) per ogni millilitro di Stripper cellule usate sono poi aggiunti alle cellule.
4. Le cellule vengono conteggiati utilizzando un emocitometro. 5 x 10 ³ ST88-14 cellule sospese in 3 ml verrà iniettato per mouse. Una quantità di cellule sufficiente per innestare l'intera coorte, con indennità per il pipettaggioerrore (ad esempio, per 35 topi, di solito trasferire un numero di cellule sufficiente per innestare 40 topi), viene trasferita in un tubo sterile 1,5 ml. Le cellule sono centrifugate a 3000 rpm per 5 minuti. Il surnatante viene accuratamente rimosso e il pellet risospeso in DMEM10 (Nota: puromicina non è incluso in questo mezzo) ad una concentrazione finale di 5 x 10 ³ cellule per 3 ml. Mantenere le cellule in ghiaccio.

3. L'innesto Protocollo

1. I topi vengono anestetizzati nella camera di induzione di un vaporizzatore isoflurano fino a quando non ritirare i loro arti posteriori ad uno stimolo pizzico dito del piede. I topi sono posti dalla loro parte e iniettata per via sottocutanea di 0,05 mg / kg di hydrocholoride buprenorfina. L'anestesia è poi mantenuta attraverso la somministrazione continua di isoflurano consegnato tramite il naso a cono. Si prega di notare che un topo eutanasia è stata usata per dimostrare la procedura per il video, di conseguenza, il tubo isoflurano usati per fornire isoflurano non è visibile nel video.
2. Per mantenere la temperatura corporea, gli animali vengono trattati su una piastra elettrica per tutto il processo di innesto. Per prevenire l'essiccamento della cornea, una piccola goccia di pomata oftalmica (unguento Puralube veterinario) viene somministrato a ciascun occhio. In quanto sarà necessario per ogni mouse per essere identificato in modo univoco in tutto il processo, una marca auricolare con un numero identificativo univoco viene troncato per l'orecchio destro di ogni topo.
3. Animale posto sullo stomaco, diffondendo le zampe posteriori. Coprire il mouse con una garza sterile, esponendo alla finestra chirurgica (fianco), dove l'innesto si verificherà. Il telino sterile dovrebbe consentire la visualizzazione della testa, sia per garantire che il naso è ancora dentro il cono e per consentire il monitoraggio della respirazione e il colore dell'animale. Applicare betadine al sito chirurgico con un applicatore con la punta di cotone, a partire dal centro del fianco e gradualmente a spirale verso l'esterno per i bordi della finestra chirurgica. Etanolo al 70% viene quindi applicata al sito chirurgico nella stessa maniera. Applicazioni consecutive di betadine seguito da etanolo sono ripetuti due volte.
4. Rimuovere le cellule dal ghiaccio e sia delicatamente vortice o sfogliare la provetta per risospendere le cellule risolta. Usando una pipetta, rimuovere 3,2 ml di sospensione cellulare ed espellerlo su un pezzo di Parafilm. Eliminando più di quanto sia necessario e l'immissione della sospensione in Parafilm, possiamo garantire che non ci siano bolle in sospensione e che abbiamo un totale 3 ml per l'iniezione. Tirare la maggior quantità di sospensione cellulare possibile in una siringa da 10 L Hamilton dotato di un ago 33 gauge. Bolle Flick dalla siringa ed espellere la sospensione per eccesso di cellule esattamente 3 ml. Tenere le cellule e la cella contenente siringa sul ghiaccio fino al momento dell'uso, per assicurarsi che l'ago rimane sterile, non permettono il contatto con il ghiaccio o il secchio. Un pezzo di pellicola trasparente può essere posizionato sulla parte superiore del ghiaccio per la siringa dal diretto contatto con il ghiaccio.
5. Usando un bisturi n ° 4 manico dotato di una lama di 22 N. bisturi, fare un'incisione attraverso la pelle del fianco appena sotto e parallelo al femore; fare in modo che l'incisione non si estende oltre i limiti del campo chirurgicamente rimosso. Aprire l'incisione cutanea con una pinza chirurgica o manualmente per esporre il muscolo sottostante. Un aereo fasciale sarà visibile per tutta la lunghezza della gamba, il nervo sciatico si trova sotto questo e tra i due muscoli collegati dalla fascia. Utilizzando un paio di forbici a punta tagliente, schietto sezionare attraverso questa fascia per esporre il nervo sciatico, che dovrebbe essere evidente come una struttura lineare bianco circa lo spessore di un filo di spessore.
6. Utilizzando un paio di pinze curve appuntiti, con attenzione sezionare sotto il nervo, allentando dal muscolo sottostante, questo sia eleva e isola il nervo. Lascia la pinza sotto il coraggio di mantenere questa posizione. Inserire con cautela l'ago della siringa Hamilton nel nervo, cercando di mantenere l'angolo di iniezione in parallelo con il nervo possibile in modo che l'ago non puntura attraverso la parte inferiore del nervo. L'ago deve essere inserito verso la fine del nervo distale al rachide-abbiamo trovato che l'iniezione di cellule tumorali nel nervo verso il midollo spinale stabilisce le cellule tumorali innestati in una maggiore vicinanza al midollo spinale. In questo caso, le cellule tumorali spesso invadono il midollo spinale, con conseguente perdita prematura degli animali del gruppo di studio a causa di compromesso della funzione del midollo spinale.
7. Una volta che l'ago è posizionato correttamente nel nervo, rilassare la tensione prodotta nel nervo dal forcipe e iniettare lentamente le cellule dalla siringa nel nervo più di 45-60 secondi. E 'essenziale che ciò avvenga lentamente, quanto più rapidamente l'espulsione dei contenuti siringa si tradurrà in un "back-wash" delle cellule tumorali in tutto il sito di iniezione e la loro perdita. Dopo tutte le cellule sono state iniettate con successo, estrarre lentamente l'ago per minimizzare la perdita di materiale iniettato.
8. Per rimuovere ilporcini e con attenzione luogo nevralgico di nuovo nella sua posizione originale sotto il muscolo. Chiudere l'incisione chirurgica con Vetbond colla chirurgica. Tenere incisione insieme con una pinza per circa 20 secondi per consentire la colla per asciugare.
9. Il mouse viene rimosso dal isoflurano naso-cono e messo da solo in un letto senza gabbia per recuperare. Questa gabbia deve essere tenuto in cima ad una piastra elettrica fino a quando l'animale ha pienamente recuperato. Parte della gabbia di recupero non dovrebbe essere su una piastra elettrica, questo permette all'animale di allontanarsi dal caldo, se troppo caldo. A seguito di innesto, gli animali devono essere valutati regolarmente per masticare nel sito, zoppia o anoressia; questi segni potrebbero indicare l'animale è ancora nel dolore e che gli analgesici corretta dovrebbe essere data. Dopo aver fatto esperienza con questa procedura, abbiamo scoperto che i topi 30-40 può essere facilmente innestato in un solo giorno.

4. Valutazione del successo del trapianto e randomizzazione in gruppi di studio

1. L'imaging bioluminescenza è usato per valutare il successo della procedura di innesto. Usiamo un sistema IVIS-100 (originariamente da Xenogen, che ora è conosciuto come Calibri Inc.) per rilevare emissione di luce da tumore espresso luciferasi lucciola che si produce come risultato della reazione chimica della luciferasi con il suo substrato, D-Luciferin . Le analisi di queste immagini determinare se specifici topi innestate sono adatti per l'ingresso nel coorti sperimentazione terapeutica. In esperimenti preliminari, abbiamo quantificato i segnali rilevabili bioluminescenza, topi sacrificati innestate, raccolte le loro tumori e correlati pesi tumore con i segnali di bioluminescenza dalla regione di analisi di interesse utilizzando il software Vivere immagine del produttore. Questi studi hanno dimostrato che c'era una correlazione lineare tra il peso del tumore e trapianto emissione luminosa bioluminescenza, indicando che l'imaging bioluminescenza è un mezzo appropriato surrogato per valutare la crescita trapiantati in tutto il corso di studi preclinici. Tipicamente ci image 5 topi allo stesso tempo. Ulteriori dettagli sulla bioluminescenza immagini sono state pubblicate in precedenza ^7.
2. Per valutare il successo del trapianto, l'imaging bioluminescenza viene eseguita 1 e 3 giorni dopo l'innesto. Le immagini sono raccolte da topi orientate nella stessa posizione di 10 minuti dopo l'iniezione intraperitoneale di 2,5 mg di D-Luciferin. Durante l'imaging, i topi sono mantenuti in anestesia isoflurano e la loro temperatura corporea mantenuta a 37 ° C da una piastra elettrica presenti nel imager Xenogen. Tempi di acquisizione delle immagini sono nella gamma di 2 sec a 10 min, il software di acquisizione dati assicura che nessun pixel sono saturati durante la raccolta delle immagini. Emissione di luce provenienti da regioni del tumore (conta fotone relativa / sec) è misurata utilizzando software proprietario da Xenogen. Intensità di emissione di luce è rappresentato dalla scala pseudocolore della bioluminescenza che è sovrapposto su fotografie in bianco e nero dei topi che sono raccolti nello stesso momento.
3. Per essere ammessi per l'inclusione in una coorte di prova pre-clinici, i topi deve avere un segnale rilevabile bioluminescenza sia 1 e 3 giorni dopo l'innesto e l'intensità del segnale di bioluminescenza deve aumentare tra i giorni 1 e 3. Gli animali che hanno un segnale di diminuzione o statici sono esclusi. Inoltre, i segnali rilevati nei topi innestato lo stesso giorno dovrebbe essere entro 1 ordine di grandezza di ogni altro, i topi con segnali bioluminescenza che sono un ordine di grandezza inferiore o superiore a quelli rilevati negli animali innestati nello stesso giorno sono esclusi.
4. Una volta che i topi sono stati identificati che rispondono a questi criteri, devono essere randomizzati in gruppi di trattamento. Per raggiungere questo obiettivo, i segnali luciferasi rilevato nei topi innestati 3 giorni dopo l'innesto vengono prima ordinati in ordine decrescente di intensità. I topi sono poi randomizzati in gruppi per l'assegnazione in ordine di intensità ai gruppi di trattamento, invertendo l'ordine e poi ripetendo il processo fino a quando tutti i topi vengono assegnati ai gruppi. Per esempio, se ci sono 4 gruppi di trattamento (ad esempio, placebo e tre concentrazioni di farmaco di prova) i topi sono assegnati ai gruppi in ordine 1, 2, 3, 4, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3 , 4, 4, 3, 2, 1 .. ecc Prima di iniziare il trattamento, i segnali bioluminescenza rilevato in ciascun membro del gruppo assegnato viene calcolata la media per assicurarsi che i segnali di partenza media all'interno di tutti i gruppi sono il più vicino possibile. La somministrazione di agenti terapeutici candidato è iniziata il giorno 3.
5. Per valutare l'effetto terapeutico è l'agente di innesto sulla crescita nel corso del trattamento, l'imaging bioluminescenza viene effettuata una volta a settimana dopo la terapia iniziale (giorni 10, 17, 24, 30 post-trapianto). Per i topi immunodeficienti non nudo, è estremamente importante che gli animali hanno ancora una volta una nuova crescita pelliccia rimosso con Nair prima di eseguire ogni sessione di imaging. Questo perché i capelli blocca i segnali bioluminescenti, con colore del mantello determinare la quantità del segnale è perso. Per esempio, pelliccia bianca come si trova in Svizzera Webster topi produce una riduzione del 18% dell'intensità del segnale bioluminescente ^8, mentre pelliccia nera può diminuire i segnali fino a 10 volte ^9. Vorremmo inoltre notare che non si può presumere che la ricrescita pelo uniforme si verifichino in tutti i gruppi di trattamento e di "normalizzare" la riduzione del segnale tra i gruppi di trattamento. Questo perché l'agente terapeutico si può influenzare la crescita dei capelli. Per esempio, abbiamo notato che il trattamento con tamoxifene inibisce la ricrescita dei capelli, riducendo al minimo l'effetto percepito di questo agente sulla crescita tumorale rispetto ai topi trattati con placebo.
6. Con ST88-14 MPNST cellule, i topi possono essere effettuate per 30 giorni post-trapianto. In questo momento, i tumori in genere hanno cresciuto alla dimensione massima consentita per la cura degli animali e dei comitati istituzionali uso e devono essere sacrificati. Dopo la sessione di imaging finale, i topi vengono uccisi ed i campioni necessari per l'ulteriore analisi dei risultati di trattamento (ad esempio, il sangue per la determinazione dei livelli circolanti di agente terapeutico, tessuto tumorale per la determinazione del peso, l'esame di istologia, la determinazione di Ki67 e indici di etichettatura e TUNEL valutazione dei parametri biochimici) raccolti. Esattamente ciò che i campioni vengono raccolti dipenderà dalle esigenze del disegno sperimentale.
7. I topi con tumori dovrebbero essere monitorati giorno e risolto se si ammalano (grooming mancanza normali e comportamenti di evitamento), non sono in grado di mangiare o bere, o se il tumore diventa troppo grande da impedire i normali movimenti del corpo. Tumorale non dovrebbe essere consentito di superare il 10% del peso corporeo normale dell'animale. Peso del tumore come percentuale del peso corporeo viene calcolata confrontando il peso degli animali cuscinetto tumore al peso di età / sesso animali di controllo abbinati. Cachessia non dovrebbe essere permesso di diventare clinicamente significativo. Perdita di peso in animali portatori di tumore non deve superare il 20% del peso corporeo normale.

5. Rappresentante dei risultati:

La figura 1 illustra l'aumento progressivo tipico bioluminescenza osservato 1-18 giorni post-trapianto in caso di trapianto ortotopico correttamente stabilito in un nudo (NIH III) mouse (CA). Quantificazione dei segnali bioluminescenza osservato 1-24 giorni dopo l'innesto mostra che, sebbene questi segnali progressivamente aumentare, la crescita tumorale accelera notevolmente nelle fasi successive del periodo di studio (Figura 1D). Per rigorosamente dimostrare che la crescita del tumore si è verificata nei topi innestati, ci vengono raccolti abitualmente il nervo sciatico e, se risulta che il tumore si è rotto epinevrio e invaso i tessuti adiacenti, che circonda i tessuti molli e muscolo scheletrico. Data la crescita aggressiva di MPNSTs, non sorprende che spesso troviamo che le cellule tumorali hanno innestato violato le normali barriere del nervo e hanno invaso i tessuti adiacenti (figura 1E). Abbiamo anche spesso che le cellule migrano MPNST innestato aggressivamente in nervo prossimale e distale al sito di innesto.

Figura 1. Immagini bioluminescenza di NIH III del mouse ortotopicamente innestati con luciferasi-tagged cellule MPNST 1 giorno post-trapianto (A). Si noti che i segnali rilevati all'interno della regione di interesse (ROI) in diversi tipi di mouse sono tutti a un ordine di grandezza di ogni altro. Re-imaging 10 giorni (B) e 18 giorni (C) post-trapianto dimostra che i segnali bioluminescenti aumentare progressivamente nel sito del trapianto nei topi individuali. (D) Il grafico illustra il progressivo aumento del fotone relativi conteggi / secondo rilevata sul sito del trapianto 1-24 giorni post-trapianto. (E) Micrografia del sito trapianto da questo mouse che dimostrano la crescita del tumore e l'invasione focale nella adiacente muscolo scheletrico.

Discussione

Il metodo ortotopico dettagliati xenotrapianto qui presentato è quello che abbiamo sviluppato utilizzando ST88-14 MPNST cellule, una linea che è ampiamente utilizzato negli studi di questi NF1 associate a tumori della guaina dei nervi periferici. Tuttavia, questa metodologia è facilmente adattabile per studi preclinici con altre linee cellulari MPNST. Per esempio, abbiamo anche effettuato ortotopico xenotrapianto con STS-26T ¹⁰ celle, una linea derivata da un sporadici MPNST e T265-2c ¹¹ celle, che sono derivati ​​da un NF1 associate MPNST, con un successo simile a quello che abbiamo osservato con ST88 -14 cellule.

Detto questo, si segnala che le condizioni esatte che descriviamo qui per ortotopico xenotrapianto di ST88-14 le cellule non possono essere direttamente adottata per l'innesto delle linee MPNST altri. Invece, i parametri chiave della metodologia deve essere empiricamente determinato per ogni linea cellulare. Questi parametri includono il numero di cellule MPNST inizialmente innestato, il tempo concesso per lo sviluppo del trapianto e, in misura minore, il volume in cui le cellule tumorali vengono iniettate. Per stabilire questi parametri per una nuova linea, abbiamo gruppi di topi innesto (5 topi per gruppo) con ^03-5 ottobre x 10 ⁶ cellule tumorali, controllando due concentrazioni di cellule per ogni ordine di grandezza (cioè, 10 ³ celle, 5 x 10 ³ celle, 10 ⁴ celle, 5 x 10 ⁴ cellule, ecc.) Un maggior numero di cellule tumorali (> 10 ⁶⁾ deve essere iniettato in un volume più grande, abbiamo scoperto che fino a 5 ml può essere iniettato senza perdita di cellule del nervo innestato. Abbiamo anche scoperto che non più di 5 x 10 ⁶ cellule tumorali per 5 ml di volume può essere iniettato come sospensioni dense diventano sempre più inclini a taglio che uccide le cellule tumorali. Seguiamo questi topi fino ad almeno tre animali all'interno di ogni gruppo hanno tumori palpabili, a quel punto abbiamo porre termine a tale gruppo ed esaminare istologicamente il coraggio di confermare la crescita del trapianto. Ovviamente, il tempo necessario per arrivare a questo punto sarà diverso, a seconda del numero di cellule iniettate, in generale, stiamo cercando una concentrazione di cellule che raggiungerà la massima ammissibile di crescita del tumore entro 30-60 giorni. Crescita più rapida può rendere difficile da raggiungere concentrazioni terapeutiche efficaci prima della risoluzione della sperimentazione e / o impedire la raccolta di datapoint sufficiente di imaging bioluminescenza nel corso degli esperimenti. Un corso di tempo più lungo di 60 giorni permette di regolare parametri sperimentali ingombranti e prolunga inutilmente la durata degli esperimenti previsti.

Infine, vorremmo anche notare che abbiamo utilizzato questa metodologia ortotopico xenotrapianto con ST88-14 cellule trapiantate in topi NIH III per dimostrare l'efficacia terapeutica di tamoxifene ^6. Una descrizione dettagliata dei metodi che usano abitualmente per valutare gli effetti degli agenti terapeutici candidato su xenotrapianti ortotopico si trovano in quel manoscritto. E 'stato anche dimostrato che le cellule neurofibroma può essere innestato con successo in nervo periferico ^12, suggerendo che, con modifiche, le procedure descritte in questo protocollo può essere utilizzato per eseguire studi preclinici con agenti terapeutici diretti contro candidato neurofibromi.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Foxchase outbred SCID mice	Charles River Laboratories	#236
NIH III mice	Taconic	#NIHBNX
NOD-SCIDγ mice	Jackson Laboratory	#005557
Cell Stripper	Fisher Scientific	25-056-cl
Vetbond surgical glue	3M	1469SB
Hamilton syringe	Hamilton Co	#80030	10 μL volume
Hamilton syringe needles	Hamilton Co	#7803-05	33 Ga., 0.5 inch, PT4 (custom made)
Ear tags	National Band and Ear Tag Co.	1005-1
Ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38