Ex vivo de imágenes de células T en los ganglios linfáticos murino Rebanadas con campo amplio y microscopios confocal

Resumen

Este protocolo describe un método para células T de imagen fluorescente introducido en rodajas los ganglios linfáticos. La técnica permite en tiempo real, análisis de la migración de las células T con las tradicionales de fluorescencia de campo amplio o microscopios confocal.

Resumen

Células T naive continuamente el tráfico de órganos linfoides secundarios, incluyendo los ganglios linfáticos periféricos, para detectar antígenos expresados ​​raro. La migración de las células T en los ganglios linfáticos es un proceso complejo que implica factores celulares y químicos, incluyendo las quimioquinas. Recientemente, el uso de la microscopia de dos fotones ha permitido hacer un seguimiento células T en los ganglios linfáticos intactos y para obtener alguna información cuantitativa sobre su comportamiento y sus interacciones con otras células. Mientras que hay ventajas obvias para un sistema in vivo, este enfoque requiere una instrumentación compleja y costosa y ofrece un acceso limitado a los tejidos. Para analizar el comportamiento de las células T en los ganglios linfáticos murino, hemos desarrollado un ensayo de corte ^1, originalmente creado por los neurobiólogos y adaptado recientemente a murino timo ^2. En esta técnica, marcado con fluorescencia células T se colocan en la parte superior de una porción de ganglios linfáticos extremadamente preparado. En este video-artículo, la localización y la migración de las células T en el tejido se analiza en tiempo real con un campo amplio y un microscopio confocal. La técnica que complementa en vivo de dos fotones microscopía ofrece un método eficaz para la imagen las células T en su entorno natural y para dilucidar los mecanismos subyacentes de migración de las células T.

Protocolo

1. Rebanadas de la preparación de los ganglios linfáticos

1. Preparar un 4% de bajo punto de fusión solución de agarosa para incrustar. Diluir agarosa en PBS y microondas esta solución. Cuando la agarosa se disuelva por completo, mantener la solución a 37 ° C hasta que esté listo para su uso.
2. Prepare una placa de tejido de 6 pocillos. Añadir 1,1 ml de medio de cultivo RPMI completo por pozo, e insertar un filtro de organotípicos en cada pozo. Coloque la placa de 6 pocillos a 4 ° C hasta el momento de la transferencia de las rebanadas.
3. Coloque las arandelas de acero inoxidable, con un diámetro interior de 4 mm, en un plato de plástico llena de medio RPMI completo. Arandelas serán más utilizado para concentrar las células en el segmento de corte vibratome.
4. El sacrificio del ratón, de acuerdo con las normas locales de bienestar animal. Retire con cuidado los ganglios linfáticos periféricos del tejido circundante y colocarlas en un plato de plástico con helado de PBS. Se debe tener cuidado de no dañar la estructura de los ganglios linfáticos, ya que estos órganos son muy suaves.
5. Vierta el 4% en gel de agarosa en un plato de plástico de 35 mm y con delicadeza la transferencia de los nodos en el gel. Deje el gel de agarosa en hielo durante 5 min a endurecerse.
6. Retire el bloque de la antena y recortar el agar con el fin de salir de 3-5 mm de gel alrededor de cada uno de los ganglios linfáticos.
7. Conecte los nodos integrados en el disco de muestra del vibratome con adhesivo tisular no tóxico. Instale el disco muestra en la bandeja llena de helado de PBS.
8. La sección de agar de tejidos embebidos en el espesor de micras 320 con la velocidad vibratome conjunto en una serie lenta (0,3 mm / s) y la frecuencia de vibración establecidos en un rango medio (1,5 mm).
9. Con cuidado, la transferencia de las rebanadas de ganglios linfáticos, ya que se están reduciendo en los insertos de cultivo organotípico usando unas pinzas finas. Coloque 3 rebanadas en cada inserción. Tenga mucho cuidado en forma de filetes se pueden dañar fácilmente. Un nodo típico linfáticos periféricos producirán cinco secciones cuando se corta a 320 micras. Desechar las rodajas de primera y la última, ya que sólo contienen tejido superficial.
10. Coloque las arandelas de acero inoxidable en cada sector individual. Asegúrese de que las arandelas están bien posicionados en la agarosa alrededor del tejido.
11. Incubar la placa de cultivo a 37 ° C en un 5% de CO ₂ humidificado incubadora hasta el momento de la placa de células T.

2. Aislar las células T de los ganglios linfáticos del ratón

1. Aislar las células T de acuerdo con el artículo publicado anteriormente JoVe ^3.
2. Utilizar las células T de inmediato y proceder a la siguiente sección. De lo contrario, los linfocitos pueden ser cultivadas durante la noche, en completo RPMI-medio suplementado con 10 ng / ml de IL-7.

3. Etiquetado de las células T aisladas

1. Lavar las células en HBSS. Resuspender en el mismo tampón a 10 x 10 ⁶ por ml.
2. Añadir el mismo volumen de HBSS conteniendo 1 mM celular Rastreador verde CMFDA dando una concentración final de 0,5 mM.
3. Incubar la suspensión de células a 37 ° C durante 5 min. Lavar las células dos veces con RPMI completo y medio plazo.
4. Resuspender las células a una concentración final de 10 x 10 ⁶ por ml en RPMI completo y medio plazo. Estas células marcadas se sembraron en los cortes.

Otros colorantes fluorescentes que CMFDA podría ser utilizado también, pero ten en cuenta que estas moléculas son potencialmente tóxicos por encima de ciertas concentraciones.

4. Revestimiento etiquetados células T en rodajas los ganglios linfáticos

1. Retire el exceso de contenido medio en la parte interior de la lavadora con una pipeta. No permita que el tejido se seca, trabajar de forma rápida durante este paso.
2. Suavemente prescindir de 10 a 20 l etiquetados células T que corresponde a 1 a 2 x 10 ⁵ células en la parte interior de la lavadora. Se debe tener cuidado de no tocar el tejido con la punta de la pipeta. Asegúrese de que la gota de suspensión celular se mantiene en su lugar.
3. Colocar las rebanadas con las células en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO ₂ por lo menos 30 minutos para permitir que los linfocitos migran hacia los tejidos.

5. Imágenes de las células T en rodajas los ganglios linfáticos

En este video-artículo, las células T de imagen fluorescente en rodajas de ganglios linfáticos con un microscopio de campo amplio invertida y un microscopio confocal en posición vertical.

1. Ajuste la temperatura a 37 ° C. Nuestros microscopios están equipados con cámaras de temperatura controlada.
2. Instalar un sistema de perfusión que permite la perfusión continua de la rebanada de ganglios linfáticos con oxigenada (5% _CO2, 95% O ₂₎ rojo fenol libre de medio RPMI. En nuestro sistema, los medios de comunicación perfusión entra en la cámara de imágenes de un lado por la gravedad. El medio es aspirado con una bomba conectada a un matraz de recogida de residuos. Establecer la velocidad de flujo de los medios de comunicación de 1 ml / min.
3. Con unas pinzas finas, delicadas sacar el trozo de la placa de 6 pocillos y se moje la preparación en caliente oxigenada medio RPMI durante unos segundos para deshacerse de células fluorescentes no se infiltraron en el tejido.

Imaging células T con un microscopio invertido de gran campo

4. Coloque el corte hacia abajo en una cámara de imágenes a medida que se compone de hilos de nylon pegado en la parte interior de un plato con fondo de cristal. En esta cámara, los hilos de nylon elevar el sector a partir de la copa y que la solución oxigenada de difundir en el tejido. Esto es necesario como la migración de las células T en los ganglios linfáticos es fuertemente dependiente de oxígeno. Asegurar el corte, añadiendo en él una arandela de acero inoxidable. En estas condiciones, el segmento se encuentra a unas pocas micras por encima del fondo del plato, lo que facilita la renovación de la solución de perfusión.
5. Para capturar un gran campo de visión (800 x 800 m, aproximadamente un tercio de la superficie de corte del nodo), recoger las imágenes con un lente de 10x objetivo seco. Se encontró que el 10 veces Nikon S fluor 0,5 NA era el más adecuado para nuestro análisis.

Un típico experimento de time-lapse de imágenes ha capturado 5 aviones óptica que abarca una profundidad total de 50 micras en el axial (z) dimensión. Fluorescente las células T son generalmente imágenes en intervalos de entre 10 a 30 segundos durante 10 a 20 min.

Imágenes de las células T con un microscopio confocal vertical

El microscopio confocal utilizados en este protocolo es una Leica SP5 equipado con un objetivo de 20x de inmersión de agua (Olympus, 20x/0.95 NA).

6. Asegurar la división para la etapa de formación de imágenes del microscopio. Nota: Por lo general, coloque una arandela en la preparación para inmovilizarlo.
7. Establecer una sesión de imágenes mediante la recopilación de una serie de imágenes a lo largo del eje z. A las células T de imagen en una estructura de tejido intacto, la posición de inicio se suele fijar entre 5 y 10 micras por debajo de la célula T primera etiqueta.

6. Los resultados representativos

Siguiendo este video-protocolo que debe esperar para visualizar un gran número de células T fluorescentes acumuladas en la zona T del nodo, un fenómeno que ocurre normalmente en este entorno particular en vivo (Figura 1). En particular, las células T deben ser excluidos de las zonas de células B, que son por lo general sólo debajo de la cápsula. Un experimento exitoso también dará lugar a las células T reclutados en el tejido (Figura 2), mostrando un comportamiento muy móviles (Figura 3), en consonancia con los resultados publicados obtenidos en los ganglios linfáticos intactos ^4. En promedio, la velocidad media de cada uno de las células T en lonchas deben ser cerca de 10 m / min (Figura 4).

Figura 1. Las células T se acumulan en una rebanada de los ganglios linfáticos. Fluorescentemente marcado células T (CMFDA, verde) se han añadido a un ganglio linfático corte 30 minutos antes de la adquisición de imágenes (imagen superior). La imagen es la proyección máxima de 5 imágenes hasta los 50 m en la dirección z. La imagen de campo claro se muestra en la parte inferior. Las imágenes fueron capturadas con un microscopio de campo amplio.

Figura 2. Las células T son reclutados en una porción de los ganglios linfáticos. Fluorescentemente marcado células T (CMFDA, verde) se han añadido a un ganglio linfático corte 30 minutos antes de la adquisición de imágenes con un microscopio confocal. Las imágenes fueron capturadas en la superficie de corte (foto superior) y 40 m por debajo (foto inferior).

Figura 3. Las células T son muy móviles dentro de una porción de los ganglios linfáticos. Fluorescentemente marcado células T fueron estudiados durante 12 minutos usando un microscopio de campo amplio. Trayectorias individuales de las células T se muestran como un código de colores para representar las pistas desplazamientos cada vez mayor de azul (bajo número de células móviles) a rojo (células móviles de alta). Pistas se calcularon utilizando software Imaris. La línea blanca sigue el borde del nodo, mientras que el óvalo de puntos delimita la zona B de células putativo.

Figura 4. Dentro de una porción de los ganglios linfáticos, la velocidad de las células T está cerca de 10 m / min. Las velocidades se calcularon utilizando software Imaris de pistas representado en la figura 3.

Discusión

Hemos descrito una técnica sencilla, rápida y robusta para la generación de cortes de ganglios linfáticos, que se utilizan para investigar el comportamiento de las células T introdujo. En los últimos años, este método ha sido aplicado con éxito el uso del timo y las rodajas de los ganglios linfáticos para identificar los factores extracelulares controlar el posicionamiento de las células T y la motilidad de ^1,5. También se ha utilizado para medir las respuestas de Ca ^{2 +} en timocitos durante la selección positiva y en las células T en el reconocimiento de antígenos ^2,6. El ensayo parte de superposición presenta ventajas e inconvenientes que merecen ser discutidos. Es de destacar que este sistema permite el acceso a los tejidos, muy útil si se necesita para manipular farmacológicamente rebanadas con el fin de interferir con el control molecular de la migración celular. Con posterioridad a la imagen, las cortes pueden ser procesadas para inmunohistoquímica para recoger más información sobre las estructuras que han sido fotografiadas. Por otra parte, la observación se puede hacer con un microscopio de fluorescencia tradicionales de campo amplio. Aunque la resolución no es tan buena como con un microscopio confocal o de dos fotones, y que la fototoxicidad es, en principio, más grave, con un fotón que con el microscopio de dos fotones, tiene la ventaja de la simplicidad, un costo más bajo y mayor elección de longitudes de onda de excitación.

La imagen de las células T en un ganglio linfático intacto requiere la inyección intravenosa de linfocitos marcados que, posteriormente, el hogar de los órganos linfoides. Como hemos demostrado anteriormente ^1, el ensayo de corte es perfectamente compatible con los experimentos de transferencia adoptiva. Sin embargo, el tiempo necesario para que las células T a la casa de los ganglios linfáticos pueden complicar el uso de colorantes fluorescentes que tienen una tendencia a salirse de las células a través del tiempo. Este es el caso de la Ca ^{2 +} colorante fura-2. Con el reclutamiento rápido (<30 min) de las células T en el tejido, el ensayo de corte ofrece la oportunidad de usar estos colorantes. Finalmente, este método tiene la gran ventaja de analizar las funciones de las células T en varios tejidos humanos mantiene viva.

Este sistema experimental también presenta limitaciones que deben tenerse en cuenta. Los daños asociados con el corte pueden afectar el funcionamiento de las células T, especialmente en la región superficial del tejido cerca de la superficie de corte. A fin de evaluar la muerte celular en el sector, hemos utilizado el colorante fluorescente verde SYTOX que penetra en las células con la membrana plasmática comprometida. Nuestros experimentos muestran que alrededor del 20% del total de las células ganglionares, en su mayoría localizadas en la región superficial del tejido, fueron etiquetados con fluorescencia con este colorante nuclear. Otro problema potencial con el ensayo es la capacidad de los sectores para conservar importantes factores solubles como las quimiocinas. Aunque, no tenemos ninguna indicación de que nuestros datos se vieron afectados por este tipo de problemas ya que las células T muestran una buena movilidad en el sector, nos gustaría hacer hincapié en la importancia de la imagen de las células T en las regiones de salud ubicados en varias decenas de micrones de la superficie de corte. Considerando que, con esto se podría hacer con los microscopios tradicionales (o de campo amplio confocal), como en este protocolo, es probable que el ganglio linfático rebanada preparación combinada con dos fotones de imagen aumentará la resolución espacial en profundidad y reducir la fototoxicidad.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Microscopio confocal	Leica	SP5
Vibratome	Leica	VT1200S
Pinzas finas	Mundial de Instrumentos de Precisión	14142
30 inserciones de Cultura mm	Millipore	PICM0RG50
RPMI	Invitrogen	61870010	Completo RPMI-medio se realiza mediante la adición de un 10% inactivado por calor suero fetal bovino y penicilina / estreptomicina
Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS)	Invitrogen	14170088
Baja la temperatura de gelificación de agarosa, el tipo VII-A	Sigma-Aldrich	A0701
Cianoacrilato de butilo pegamento, Vetbond	3M	1469
Arandelas de acero inoxidable, 4 mm de diámetro interior	Bricolaje
Rastreador de células verdes CMFDA	Invitrogen	C7025