Ex vivo de imagens de células T em fatias Node murino linfáticos com Widefield e microscópios confocal

Resumo

Este protocolo descreve um método para células T imagem fluorescentes introduzido em fatias de linfonodos. A técnica permite análises em tempo real de migração de células T com o tradicional campo amplo de fluorescência ou microscópios confocal.

Resumo

Ingênua células T tráfego continuamente para órgãos linfóides secundários, incluindo linfonodos periféricos, para detectar antígenos expressos rara. A migração de células T em linfonodos é um processo complexo que envolve fatores tanto celulares e químicas, incluindo quimiocinas. Recentemente, o uso de dois fótons de microscopia permitiu rastrear as células T nos linfonodos intactos e para obter alguma informação quantitativa sobre o seu comportamento e suas interações com outras células. Embora existam vantagens óbvias para uma no sistema vivo, esta abordagem requer uma instrumentação complexa e cara e oferece acesso limitado ao tecido. Para analisar o comportamento de células T dentro dos gânglios linfáticos murino, desenvolvemos um ensaio ¹ fatia, originalmente criado pelos neurobiólogos e transposta recentemente para timo murino ^2. Nesta técnica, fluorescente etiquetado células T são banhados em cima de uma fatia aguda preparado linfonodo. Neste vídeo-artigo, a localização e migração de células T no tecido são analisados ​​em tempo real com um campo amplo e um microscópio confocal. A técnica que complementa in vivo de dois fótons de microscopia oferece uma abordagem eficaz para células T imagem em seu ambiente natural e para elucidar os mecanismos subjacentes T migração celular.

Protocolo

1. Preparação de fatias de linfonodos

1. Prepare a 4% de baixo ponto de fusão de solução de agarose para a incorporação. Diluir agarose em PBS e microondas esta solução. Quando a agarose é completamente dissolvido, manter a solução a 37 ° C até que esteja pronto para uso.
2. Prepare um 6 bem-placa de cultura de tecidos. Adicionar 1,1 ml meio de cultura RPMI completo por poço, e inserir um filtro organotípicas em cada poço. Coloque a placa de seis poços a 4 ° C até que esteja pronto para transferir fatias.
3. Coloque arruelas de aço inoxidável, com diâmetros interno de 4 mm, em um prato de plástico cheio de meio RPMI completo. Arruelas serão mais usados ​​para concentrar as células na fatia cortada vibratome.
4. Sacrificar o rato, em conformidade com as normas de bem-estar animal local. Remova cuidadosamente os gânglios linfáticos periférico do tecido circundante e coloque-os em um prato de plástico contendo gelada PBS. Cuidados devem ser tomados para não danificar a estrutura dos linfonodos, como estes órgãos são muito macios.
5. Despeje a 4%-agarose gel em um prato de plástico de 35 mm e delicadamente os nós de transferência para o gel. Deixe o gel agarose em gelo por 5 min para endurecer.
6. Remover o bloco do prato e cortar o agar, a fim de deixar 3-5 mm de gel em torno de cada nó de linfa.
7. Anexar os nós embutido no disco exemplar do vibratome com non-toxic cola de tecido. Instalar o disco de amostra na bandeja cheia de gelado PBS.
8. Seção agar-embedded tecido em 320 mM espessura com a velocidade vibratome conjunto em uma série lenta (0,3 mm / s) ea freqüência de vibração em um conjunto de gama média (1,5 mm).
9. Transferir cuidadosamente fatias linfonodo como eles estão sendo cortados para a cultura insere organotípicas usando uma pinça fina. Coloque 3 fatias em cada inserção. Tenha muito cuidado como fatias pode ser facilmente danificada. Um linfonodo periférico típico renderá 5 seções quando cortado a 320 mM. Descartar as fatias e sobrenome, como eles só contêm tecido superficial.
10. Coloque anilhas de aço inox em cada fatia individual. Certifique-se de arruelas são bem posicionado na agarose em torno do tecido.
11. Incubar a placa de cultura a 37 ° C em 5% incubadora de CO ₂ umidificado até que esteja pronto para as células T placa.

2. Isolamento de células T dos linfonodos do mouse

1. Isolar as células T de acordo com o artigo JOVE anteriormente publicados ^3.
2. Utilização de células T imediatamente e prosseguir para a próxima seção. Caso contrário, os linfócitos podem ser cultivadas durante a noite em completa meio RPMI suplementado com 10 ng / ml de IL-7.

3. Rotulagem dos isolaram células T

1. Lavar as células em HBSS. Ressuspender-los no mesmo tampão de 10 x 10 ⁶ por ml.
2. Adicionar o mesmo volume de HBSS contendo 1 mM celular Rastreador verde CMFDA dando uma concentração final de 0,5 mM.
3. Incubar a suspensão de células a 37 ° C durante 5 min. Lave as células duas vezes com RPMI médio completo.
4. Ressuspender as células em uma concentração final de 10 x 10 ⁶ por ml em meio RPMI completo. Estas células marcadas serão semeados em fatias.

Outros corantes fluorescentes que CMFDA pode ser usado também, mas tenha em mente que estas moléculas são potencialmente tóxicos acima de determinadas concentrações.

4. Chapeamento rotulados células T em fatias linfonodo

1. Remova o meio de excesso contido na parte interna da máquina de lavar com uma pipeta. Não permita que o tecido se torne seca; trabalhar rapidamente durante esta etapa.
2. Suavemente dispensar 10-20 mL células T rotulados que corresponde a 1-2 x 10 ⁵ células na parte interna da máquina de lavar. É preciso ter cuidado para não tocar o tecido com a ponta da pipeta. Certifique-se que a gota de suspensão de células permanece no local.
3. Coloque as fatias com células em estufa a 37 ° C e 5% CO ₂ por pelo menos 30 min para permitir que os linfócitos para migrar para o tecido.

5. Células T de imagens dentro de fatias de linfonodo

Neste vídeo-artigo, que as células T imagem fluorescentes em fatias de linfonodo com um microscópio de campo amplo invertido e um microscópio confocal vertical.

1. Definir a temperatura a 37 ° C. Nossos microscópios estão equipados com câmaras de temperatura controlada.
2. Instalar um sistema de perfusão permitindo a perfusão contínua da fatia de linfonodo com oxigenada (5% CO _2, 95% O ₂₎ fenol meio RPMI red-free. No nosso sistema, media perfundidos entra na câmara de imagem de um lado pela gravidade. O meio é aspirado com uma bomba ligada a um frasco de coleta de resíduos. Definir a taxa de fluxo de mídia para 1 ml / min.
3. Com uma pinça fina, delicadamente retire a fatia do prato 6-bem e mergulhe a preparação em meio RPMI oxigenado aquecido por alguns segundos para se livrar de células fluorescentes não infiltradas no tecido.

Imaging células T com um microscópio de campo amplo invertida

4. Coloque a fatia de cabeça para baixo em uma câmara de imagem feito por encomenda, que consiste em fios de nylon colados na parte interna de um prato fundo de vidro. Nesta câmara, os fios de nylon elevar a fatia do vidro e permitem que a solução oxigenada para difundir no tecido. Isto é necessário como T migração celular em linfonodos é fortemente dependente de oxigênio. Segura a fatia acrescentando por cima em uma arruela de aço inoxidável. Nessas condições, a fatia está alguns mícrons acima do fundo do prato, o que facilita a renovação da solução de perfusão.
5. Para capturar um grande campo de visão (800 x 800 mM, aproximadamente um terço da superfície do nó fatia), recolher imagens usando uma lente objetiva de 10x e seco. Nós descobrimos que a Nikon 10x S fluor 0,5 NA foi mais adequado para nossas análises.

Uma experiência de imagens típicas de lapso de tempo captura 5 aviões óptico abrangendo uma profundidade total de 50 mm na dimensão axial (z). Células T fluorescentes são normalmente fotografada em intervalos que variam 10 a 30 segundos durante 10 a 20 min.

Células T de imagem com um microscópio confocal vertical

O microscópio confocal utilizado neste protocolo é um SP5 Leica equipada com uma objetiva de imersão de água 20x (Olympus, 20x/0.95 NA).

6. Segura a fatia para o palco de imagens do microscópio. Nota: Nós geralmente lugar uma máquina de lavar na preparação para imobilizá-lo.
7. Definir uma sessão de imagem através da recolha de uma série de imagens ao longo do eixo z. Para as células T de imagem em uma estrutura de tecido intacto, a posição de início é geralmente definida em 5 a 10 mM abaixo da célula T primeiro rotulados.

6. Resultados representativos

Seguindo este vídeo protocolo você deve esperar para visualizar um grande número de células T fluorescentes acumuladas na zona T do nó, um fenômeno que normalmente ocorre nesse ambiente específico in vivo (Figura 1). Em particular, as células T devem ser excluídas das zonas de células B, que são geralmente logo abaixo da cápsula. A experiência bem sucedida também irá resultar em células T recrutados para o tecido (Figura 2), exibindo um comportamento altamente móveis (Figura 3) consistentes com os resultados publicados obtidos nos gânglios linfáticos intactos ^4. Em média, a velocidade média de células T individuais dentro fatias devem ser cerca de 10 mM / min (Figura 4).

Figura 1. As células T se acumulam em uma fatia de linfonodos. Células fluorescente marcado T (CMFDA, verde) foram adicionados a um nó de linfa fatia min 30 antes de aquisição de imagem (imagem acima). A imagem é a projeção máxima de 5 imagens que mede 50 mm na direção z. A imagem de campo claro é mostrado na parte inferior. Imagens foram capturadas com um microscópio de campo amplo.

Figura 2. As células T são recrutados para uma fatia de linfonodos. Células fluorescente marcado T (CMFDA, verde) foram adicionados a um nó de linfa fatia min 30 antes de aquisição de imagem usando um microscópio confocal. Imagens foram capturadas na superfície de corte (figura superior) e 40 mM abaixo (foto inferior).

Figura 3. As células T são altamente móveis dentro de uma fatia de linfonodos. Fluorescente marcado células T foram fotografadas durante 12 min usando um microscópio de campo amplo. Trajetórias de células T individuais são exibidos como codificados por cores para representar faixas deslocamentos crescentes de azul (baixo células móveis) ao vermelho (alto células móveis). Faixas foram calculados utilizando software Imaris. A linha branca segue a borda do nó, enquanto a elipse tracejada delimita a zona de células B putativa.

Figura 4. Dentro de uma fatia de linfonodos, a velocidade de células T é cerca de 10 mM / min. As velocidades foram calculadas utilizando software Imaris de faixas representadas na Figura 3.

Discussão

Nós descrevemos uma técnica simples rápida e robusta para a geração de fatias de linfonodo, que são usados ​​para investigar o comportamento de células T introduziu. Nos últimos anos, este método tem sido aplicado com sucesso usando timo e linfonodo fatias para identificar os fatores extracelulares controlar o posicionamento de células T e mobilidade ^1,5. Também tem sido usado para medir Ca ^{2 +} respostas em timócitos durante a seleção positiva e em células T após o reconhecimento antígeno ^2,6. O ensaio fatia overlay apresenta vantagens e limitações que merecem ser discutidas. De notar que este sistema permite o acesso ao tecido, útil se a pessoa precisa para manipular fatias farmacologicamente, a fim de interferir com o controle molecular de migração celular. Subseqüente ao de imagem, as fatias podem ser processados ​​por imuno-histoquímica para coletar informações sobre as estruturas que foram retratadas. Além disso, a observação pode ser feita com um microscópio de fluorescência tradicional campo amplo. Embora a resolução não é tão bom quanto com uma ou um microscópio confocal de dois fótons e que fototoxicidade é, em princípio, mais grave, com um fóton do que com a microscopia de dois fótons, ele tem as vantagens de simplicidade, um menor custo e maior escolha de comprimentos de onda de excitação.

A imagem de células T em um linfonodo intactas requer a injeção intravenosa de linfócitos marcados que, posteriormente, o lar de órgãos linfóides. Como já mostrado anteriormente ^1, o ensaio fatia é perfeitamente compatível com a experiência de transferência adotiva. No entanto, o período de tempo necessário para as células T a casa em gânglios linfáticos pode complicar o uso de corantes fluorescentes que têm uma tendência a vazar para fora das células ao longo do tempo. Este é o caso do Ca ^{2 +} corante fura-2. Com o recrutamento rápido (<30 min) de células T no tecido, o ensaio fatia fornece uma oportunidade de usar tais corantes. Finalmente, este método tem a grande vantagem de analisar as funções das células T em vários tecidos humanos mantidos vivos.

Este sistema experimental apresenta também limitações que precisam ser mantidos em mente. Danos associados com o corte pode afetar o funcionamento das células T, especialmente na região superficial do tecido perto da superfície de corte. A fim de avaliar a morte celular dentro da fatia, temos utilizado a corante fluorescente verde SYTOX que penetra as células com membrana plasmática comprometida. Nossos experimentos revelam que cerca de 20% do total de células nodais, principalmente localizados na região superficial do tecido, foram fluorescente etiquetado com o corante nuclear. Outra preocupação com o potencial do ensaio é a capacidade de reter as fatias importantes fatores solúveis incluindo quimiocinas. Embora, não temos nenhuma indicação de que nossos dados foram afetados por problemas tais como as células T exibir uma boa mobilidade dentro da fatia, gostaríamos de salientar a importância das células T de imagens em regiões saudáveis ​​localizado em várias dezenas de microns da superfície de corte. Considerando que, isso poderia ser feito com microscópios tradicionais (campo amplo ou confocal), como neste protocolo, é provável que a linfa preparação fatia nó combinado com dois fótons de imagem vai aumentar a resolução espacial de profundidade e reduzir a fototoxicidade.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Microscópio confocal	Leica	SP5
Vibratome	Leica	VT1200S
Pinça fina	Precision Instruments mundo	14142
30 milímetros insere Cultura	Millipore	PICM0RG50
RPMI	Invitrogen	61870010	RPMI completo e médio é feita pela adição de 10% inativado pelo calor de soro fetal bovino e penicilina / estreptomicina
Solução de Hanks salina balanceada (HBSS)	Invitrogen	14170088
Baixa temperatura de gelificação Agarose, tipo VII-A	Sigma-Aldrich	A0701
Butil cola de cianoacrilato, Vetbond	3M	1469
Arruelas de aço inoxidável, 4 mm de diâmetro interno	DIY loja
Rastreador de celular verde CMFDA	Invitrogen	C7025