Imaging ex vivo di cellule T nel Fette murini Linfonodo con grandangolari e microscopi confocale

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo per le cellule T immagine fluorescente introdotto a fette linfonodo. La tecnica permette in tempo reale analisi della migrazione delle cellule T con widefield tradizionali microscopi a fluorescenza o confocale.

Abstract

Naïve cellule T in continuo traffico di organi linfatici secondari, compresi i linfonodi periferici, per individuare rari antigeni espressi. La migrazione delle cellule T nei linfonodi è un processo complesso che coinvolge sia fattori chimici tra cui cellulari e chemochine. Recentemente, l'uso di microscopia a due fotoni ha permesso di tracciare le cellule T nei linfonodi intatti e per ricavare alcune informazioni quantitative sul loro comportamento e le loro interazioni con altre cellule. Mentre ci sono evidenti vantaggi di un sistema in vivo, questo approccio richiede una strumentazione complessa e costosa e fornisce un accesso limitato al tessuto. Per analizzare il comportamento delle cellule T all'interno di linfonodi murini, abbiamo sviluppato un saggio fetta ^1, originariamente istituito da neurobiologi e recepita di recente per murini timo ^2. In questa tecnica, fluorescente cellule T sono placcati in cima ad una fetta linfa acutamente preparato nodo. In questo video-articolo, la localizzazione e la migrazione delle cellule T nel tessuto vengono analizzati in tempo reale con un widefield e un microscopio confocale. La tecnica che integra in vivo microscopia a due fotoni offre un approccio efficace per l'immagine delle cellule T nel loro ambiente naturale e per chiarire i meccanismi alla base della migrazione delle cellule T.

Protocollo

1. Preparare le fette di linfonodi

1. Preparare un 4% a basso punto di fusione soluzione di agarosio per l'incorporamento. Diluire agarosio in PBS e forno a microonde questa soluzione. Quando l'agarosio è completamente sciolto, mantenere la soluzione a 37 ° C fino al momento dell'utilizzo.
2. Preparare un 6-e piastra di coltura dei tessuti. Aggiungere 1,1 ml terreno di coltura RPMI completo per bene, e inserire un filtro organotipica in ciascun pozzetto. Posizionare il 6 pozzetti a 4 ° C fino al momento di trasferire fette.
3. Luogo rondelle in acciaio inossidabile, con diametro interno di 4 mm, in un piatto di plastica riempita con mezzo di RPMI completo. Rondelle saranno ulteriormente utilizzati per concentrare le cellule sulla fetta tagliata vibratome.
4. Sacrificare il mouse in conformità alla normativa vigente sul benessere degli animali. Rimuovere con cura i linfonodi periferici dal tessuto circostante e metterli in un piatto di plastica contenente ghiacciata PBS. Bisogna fare attenzione a non danneggiare la struttura dei linfonodi, in quanto questi organi sono molto morbide.
5. Versare il 4%-gel in una da 35 mm piatto di plastica e delicatamente trasferire i nodi nel gel. Lasciare il gel in ghiaccio per 5 minuti a indurire.
6. Rimuovere il blocco dal piatto e tagliare l'agar in modo da lasciare 3-5 mm di gel intorno ad ogni linfonodo.
7. Collegare i nodi incorporato nel disco campione del vibratome con colla non tossica dei tessuti. Installare il disco campione nel vassoio pieno di ghiaccio PBS freddo.
8. Sezione l'agar-embedded tessuto a 320 micron di spessore con la velocità vibratome impostato su una gamma lenta (0,3 mm / s) e la frequenza di vibrazione impostata su un medio raggio (1,5 mm).
9. Cura il trasferimento fette linfonodi mentre vengono tagliati sul inserti cultura organotipica utilizzando una pinza sottile. Posto 3 fette su ogni inserto. Fare molta attenzione come fette può essere facilmente danneggiato. Un nodo tipico linfonodi periferici produrrà 5 sezioni al taglio a 320 micron. Eliminare le fette prima e l'ultima, in quanto contengono solo i tessuti superficiali.
10. Luogo rondelle in acciaio inossidabile su ogni fetta individuali. Assicurarsi che le rondelle sono ben posizionate sul agarosio che circonda il tessuto.
11. Incubare la piastra di coltura a 37 ° C in un 5% di CO ₂ incubatore umidificato fino al momento di piatto cellule T.

2. Isolare le cellule T da linfonodi del mouse

1. Isolare le cellule T ai sensi dell'articolo precedentemente pubblicato JOVE ^3.
2. Utilizzare le cellule T e passare immediatamente alla sezione successiva. In caso contrario, i linfociti possono essere colti durante la notte in completo RPMI-medium supplementato con 10 ng / ml di IL-7.

3. L'etichettatura di isolate cellule T

1. Lavare le cellule in HBSS. Risospendere loro nel buffer stesso a 10 x 10 ⁶ per ml.
2. Aggiungere lo stesso volume di HBSS contenente 1 mM cellulare Tracker verde CMFDA dando una concentrazione finale di 0,5 micron.
3. Incubare la sospensione cellulare a 37 ° C per 5 min. Lavare le cellule due volte con RPMI completo e medie.
4. Risospendere le cellule ad una concentrazione finale di 10 x 10 ⁶ per ml in completo RPMI-media. Queste cellule etichettate saranno placcato sulla fette.

Altri coloranti fluorescenti che CMFDA potrebbe essere usato anche, ma di tenere presente che queste molecole sono potenzialmente tossici sopra determinate concentrazioni.

4. Placcatura cellule etichettati T su fette di linfonodi

1. Rimuovere l'eccesso di medie contenute nella parte interna della lavatrice con una pipetta. Non lasciare che il tessuto di diventare secco; lavorare velocemente durante questa fase.
2. Delicatamente dispensare 10-20 cellule T microlitri etichettati che corrisponde a 1 a 2 x 10 ⁵ cellule della parte interna della lavatrice. Bisogna fare attenzione a non toccare il tessuto con la punta della pipetta. Assicurarsi che la goccia di sospensione cellulare rimane al suo posto.
3. Mettere le fette con le cellule in incubatore a 37 ° C e 5% di CO ₂ per almeno 30 minuti per consentire la migrazione dei linfociti nel tessuto.

5. Imaging cellule T all'interno fette linfonodi

In questo video-articolo, le cellule T immagine fluorescente a fette linfonodale con un microscopio invertito widefield e un microscopio confocale in posizione verticale.

1. Impostare la temperatura a 37 ° C. I nostri microscopi sono dotati di camere a temperatura controllata.
2. Installare un sistema di perfusione che permette perfusione continua della fetta linfonodale con ossigenato (5% CO _2, 95% O ₂₎ rosso fenolo senza medium RPMI. Nel nostro sistema, perfusi dei media entra nella camera di immagini da una parte per gravità. Il mezzo viene aspirato con una pompa collegata ad un pallone di raccolta dei rifiuti. Impostare la portata media di 1 ml / min.
3. Con una pinza sottile, togliere delicatamente la fetta da 6 pozzetti e immergere la preparazione in riscaldato medio ossigenato RPMI per qualche secondo per liberarsi di cellule fluorescenti non infiltrato nel tessuto.

ImaGing cellule T con un ampio campo di microscopio invertito

4. Mettere la fetta a testa in giù su una misura da camera di imaging che consiste in fili di nylon incollato sulla parte interna di un piatto fondo di vetro. In questa camera, i fili di nylon elevare la fetta dal vetro e consentire la soluzione ossigenata di diffondere nel tessuto. Ciò è necessario come la migrazione delle cellule T nei linfonodi è fortemente dipendente da ossigeno. Fissare la fetta su di esso con l'aggiunta di una rondella in acciaio inox. In queste condizioni, la fetta si trova pochi micron sopra il fondo del piatto, che facilita il rinnovo della soluzione di perfusione.
5. Per catturare un grande campo di vista (800 x 800 micron, circa un terzo della superficie fetta del nodo), raccogliere le immagini utilizzando una lente a 10x obiettivo a secco. Abbiamo scoperto che il 10x Nikon S fluoro 0,5 NA era più adatto per le nostre analisi.

Un tipico time-lapse esperimento di imaging ottico cattura 5 piani che coprono una profondità totale di 50 micron in (z) dimensione assiale. Fluorescenti le cellule T sono di solito ripreso ad intervalli che vanno 10 a 30 secondi per 10 a 20 min.

Imaging cellule T con un microscopio confocale in posizione verticale

Il microscopio confocale utilizzato in questo protocollo è un SP5 Leica dotato di un obiettivo 20x immersione in acqua (Olympus, 20x/0.95 NA).

6. Fissare la sezione per la fase di imaging del microscopio. Nota: solitamente una rondella sulla preparazione per immobilizzarla.
7. Impostare una sessione di imaging, raccogliendo una serie di immagini lungo l'asse z.. Alle cellule T immagine in una struttura di tessuto intatto, la posizione di partenza è di solito impostato a 5 a 10 micron di sotto della prima cellula T etichettati.

6. Rappresentante risultati

Seguendo questo video-protocollo si dovrebbe aspettare di visualizzare un gran numero di cellule T fluorescenti accumulate nella zona T del nodo, un fenomeno che si verifica normalmente in questo particolare ambiente in vivo (Figura 1). In particolare, le cellule T dovrebbe essere esclusa dalle zone delle cellule B, che di solito sono appena sotto la capsula. Un esperimento riuscito anche portare a cellule T reclutati nel tessuto (Figura 2), mostrando un comportamento altamente mobili (Figura 3) in linea con i risultati pubblicati ottenuti nei linfonodi intatti ^4. In media, la velocità media delle singole cellule T in fette devono essere vicini ai 10 micron / min (Figura 4).

Figura 1. Le cellule T si accumulano in una fetta linfonodo. Fluorescenza marcata con cellule T (CMFDA, verde) sono stati aggiunti a un linfonodo fetta 30 minuti prima acquisizione delle immagini (foto in alto). L'immagine è la proiezione massimo di 5 immagini coprono 50 micron in direzione z. L'immagine in campo chiaro è mostrato in basso. Le immagini sono state catturate con un microscopio widefield.

Figura 2. Le cellule T sono reclutati in una fetta linfonodo. Fluorescenza marcata con cellule T (CMFDA, verde) sono stati aggiunti a un linfonodo fetta 30 minuti prima di acquisizione delle immagini utilizzando un microscopio confocale. Le immagini sono state catturate in superficie tagliata (foto in alto) e 40 micron al di sotto (foto in basso).

Figura 3. Le cellule T sono estremamente mobili all'interno di una fetta linfonodo. Fluorescenza marcata con le cellule T sono state ripreso durante 12 minuti utilizzando un microscopio widefield. Traiettorie di singole cellule T vengono visualizzati come colori tracce di rappresentare spostamenti crescente dal blu (bassa cellule mobili) a (cellule di alta mobili) rosso. Tracce sono state calcolate utilizzando il software Imaris. La linea bianca segue il bordo del nodo, mentre l'ovale tratteggiato delimita la zona delle cellule B putativo.

Figura 4. All'interno di una fetta dei linfonodi, la velocità delle cellule T è vicino ai 10 micron / min. Le velocità sono state calcolate utilizzando il software Imaris dalle tracce rappresentato in figura 3.

Discussione

Abbiamo descritto una semplice, tecnica veloce e robusto per la produzione di fette di linfonodi, che sono utilizzati per studiare il comportamento delle cellule T introdotto. Negli ultimi anni, questo metodo è stato applicato con successo con timo e linfonodi fette di identificare i fattori extracellulari il controllo del posizionamento e della motilità delle cellule T ^1,5. E 'stato anche utilizzato per misurare Ca ^{2 +} risposte in timociti durante la selezione positiva e nelle cellule T sul riconoscimento dell'antigene ^2,6. Il test fetta sovrapposizione presenta vantaggi e limitazioni che meritano di essere discussi. Di nota, questo sistema consente l'accesso al tessuto, utile se si ha la necessità di manipolare fette farmacologicamente in modo da interferire con il controllo molecolare della migrazione cellulare. A seguito di imaging, le fette possono essere trattati per immunoistochimica per raccogliere ulteriori informazioni sulle strutture che sono state fotografato. Inoltre, l'osservazione può essere fatta con un tradizionale microscopio a fluorescenza widefield. Anche se la risoluzione non è buono come con un confocale o un microscopio a due fotoni e che fototossicità in linea di principio più grave con un solo fotone che con la microscopia a due fotoni, ha i vantaggi di semplicità, un costo inferiore, e più grande scelta di lunghezze d'onda di eccitazione.

L'imaging di cellule T in un linfonodo intatto richiede l'iniezione endovenosa di linfociti etichettati che successivamente a casa per gli organi linfoidi. Come abbiamo mostrato in precedenza ^1, il test fetta è perfettamente compatibile con l'esperimento di trasferimento adottivo. Tuttavia, il tempo necessario per le cellule T a casa nei linfonodi può complicare l'uso di coloranti fluorescenti che hanno la tendenza a fuoriuscire delle cellule nel corso del tempo. Questo è il caso del Ca ^{2 +} colorante Fura-2. Con il reclutamento veloce (<30 min) di cellule T nel tessuto, il saggio fetta offre l'opportunità di utilizzare tali coloranti. Infine, questo metodo ha il grande vantaggio di analizzare le funzioni delle cellule T in diversi tessuti umani tenuti in vita.

Questo sistema sperimentale presenta anche dei limiti che devono essere tenuti in mente. Danni associati con le operazioni di affettamento può influire sul funzionamento delle cellule T, specialmente nella regione superficiale del tessuto vicino alla superficie di taglio. Al fine di valutare la morte delle cellule all'interno della fetta, abbiamo usato il colorante fluorescente verde SYTOX che penetra le cellule con membrana plasmatica compromessa. I nostri esperimenti rivelano che circa il 20% del totale delle cellule nodali, per lo più localizzate nella regione superficiale del tessuto, sono state marcate con il colorante nucleare. Un altro problema potenziale con il test è la capacità delle fette di conservare importanti fattori solubili tra cui chemochine. Anche se abbiamo alcuna indicazione che i nostri dati sono stati colpiti da problemi di questo tipo dato che le cellule T visualizzare una buona mobilità all'interno della fetta, vorremmo sottolineare l'importanza di imaging cellule T nelle regioni sano situato a qualche decina di micron dalla superficie tagliata. Considerando che questo potrebbe essere fatto con microscopi tradizionali (widefield o confocale), come in questo protocollo, è probabile che il nodo preparazione linfa fetta combinato con due fotoni di imaging aumenta la risoluzione spaziale in profondità e ridurre la fototossicità.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Microscopio confocale	Leica	SP5
Vibratome	Leica	VT1200S
Pinza multa	Mondo Strumenti di precisione	14142
30 inserti Cultura millimetri	Millipore	PICM0RG50
RPMI	Invitrogen	61870010	Completo RPMI-media è fatta aggiungendo il 10% di siero di siero fetale bovino e penicillina / streptomicina
Sale Hanks 'soluzione equilibrata (HBSS)	Invitrogen	14170088
Bassa temperatura di gelificazione agarosio, tipo VII-A	Sigma-Aldrich	A0701
Butile Colla cianoacrilato, Vetbond	3M	1469
Rondelle in acciaio inossidabile, 4 mm di diametro interno	Bricolage
Cellula Tracker verde CMFDA	Invitrogen	C7025