Ex vivo l'imagerie de cellules T dans murin tranches avec des ganglions lymphatiques et la microscopie confocale Widefield

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour imager des cellules T fluorescentes introduites dans les tranches de ganglions lymphatiques. La technique permet en temps réel des analyses de la migration des cellules T avec grand champ traditionnel fluorescence ou microscopie confocale.

Résumé

Cellules T naïves en permanence le trafic d'organes lymphoïdes secondaires, y compris les ganglions lymphatiques périphériques, afin de détecter des antigènes exprimés rares. La migration des cellules T dans les ganglions lymphatiques est un processus complexe qui implique des facteurs cellulaires et chimiques, y compris les chimiokines. Récemment, l'utilisation de la microscopie à deux photons a permis de suivre les cellules T dans les ganglions lymphatiques intactes et d'en tirer quelques informations quantitatives sur leur comportement et leurs interactions avec d'autres cellules. Bien qu'il existe des avantages évidents à un système in vivo, cette approche nécessite une instrumentation complexe et coûteux et offre un accès limité au tissu. Pour analyser le comportement des cellules T dans les ganglions lymphatiques murins, nous avons développé un test de ¹ tranche, initialement mis en place par les neurobiologistes et transposée récemment murin thymus ^2. Dans cette technique, marqué par fluorescence des cellules T sont plaqués sur le dessus d'une tranche de ganglion lymphatique aiguë préparé. Dans cette vidéo, article, la localisation et la migration des cellules T dans les tissus sont analysés en temps réel avec un grand champ et un microscope confocal. La technique qui complète in vivo microscopie à deux photons offre une approche efficace à l'image de cellules T dans leur environnement naturel et pour élucider les mécanismes qui sous-tendent la migration des cellules T.

Protocole

1. Préparation des tranches à partir des ganglions lymphatiques

1. Préparer un 4% à faible point de fusion d'agarose solution pour incorporer. Diluer agarose dans du PBS et micro-ondes cette solution. Lorsque l'agarose est complètement dissous, de maintenir la solution à 37 ° C jusqu'à utilisation.
2. Préparer une plaque de 6 puits de culture de tissu. Ajouter 1,1 ml du milieu RPMI complet de culture par puits, et d'insérer un filtre organotypique dans chaque puits. Placer la plaque de 6 puits à 4 ° C jusqu'au moment de transfert de tranches.
3. Placez les rondelles en acier inoxydable, avec un diamètre intérieur de 4 mm, dans un plat en plastique rempli d'un milieu RPMI complet. Rondelles sera en outre utilisée pour concentrer les cellules sur la tranche coupée vibratome.
4. Sacrifice de la souris en conformité avec les règles locales de protection des animaux. Retirez délicatement les ganglions lymphatiques périphériques du tissu environnant et les placer dans un récipient de plastique contenant PBS glacé. Des précautions doivent être prises pour ne pas endommager la structure des ganglions lymphatiques, car ces organes sont très doux.
5. Verser les 4%, gel d'agarose dans un plat en plastique de 35 mm et délicatement le transfert des nœuds dans le gel. Laissez le gel d'agarose sur la glace pendant 5 min à durcir.
6. Retirer le bloc de l'antenne et les garnitures de la gélose, afin de laisser 3-5 mm de gel autour de chaque noeud lymphatique.
7. Fixez les noeuds embarqués sur le disque spécimen de la vibratome avec de la colle tissulaire non-toxique. Installez le disque spécimen dans le plateau rempli de PBS glacé.
8. Section de l'agar-tissu inclus à 320 um d'épaisseur avec la vitesse vibratome mis sur une gamme lente (0,3 mm / s) et la fréquence de vibration mis sur une gamme moyenne (1,5 mm).
9. Soigneusement transfert de tranches de ganglions lymphatiques comme ils sont coupés sur les inserts culture organotypique l'aide de pinces fines. Déposer 3 tranches sur chaque insert. Utiliser le plus grand soin que les tranches peuvent être facilement endommagés. Un ganglion lymphatique périphérique sera typiquement un rendement de 5 sections lorsqu'il est coupé à 320 um. Jeter les tranches premier et le dernier, car ils ne contiennent que des tissus superficiels.
10. Placez les rondelles en acier inoxydable sur chaque tranche individuelle. Assurez-vous que les rondelles soient bien positionnés sur l'agarose entourant les tissus.
11. Incuber la plaque de culture à 37 ° C dans un 5% de CO ₂ incubateur humidifié avant d'être prêt à l'assiette des cellules T.

2. Isoler les cellules T des ganglions lymphatiques de souris

1. Isoler les cellules T en fonction de l'article précédemment publié JoVE ^3.
2. Utiliser les cellules T immédiatement et passez à la section suivante. Sinon, les lymphocytes pourrait être cultivé pendant la nuit dans RPMI complet-milieu supplémenté avec 10 ng / ml d'IL-7.

3. Étiquetage des cellules T isolées

1. Laver les cellules dans du HBSS. Les remettre en suspension dans le même tampon à 10 x 10 ⁶ par ml.
2. Ajouter le même volume de HBSS contenant 1 uM cellulaire Tracker verte CMFDA donnant une concentration finale de 0,5 uM.
3. Incuber la suspension cellulaire à 37 ° C pendant 5 min. Laver les cellules deux fois avec RPMI complet et moyen terme.
4. Resuspendre les cellules à une concentration finale de 10 x 10 ⁶ par ml dans RPMI complet et moyen terme. Ces cellules marquées seront plaqués sur les tranches.

Autres colorants fluorescents de CMFDA pourrait être utilisé aussi, mais gardez à l'esprit que ces molécules sont potentiellement toxiques au-dessus de certaines concentrations.

4. Placage étiquetés cellules T sur les tranches de ganglions lymphatiques

1. Retirer l'excès moyennes contenues dans la partie intérieure de la rondelle avec une pipette. Ne laissez pas le tissu devient sèche; travailler rapidement pendant cette étape.
2. Doucement passer 10 à 20 cellules T ul étiquetés qui correspond à 1 à 2 x 10 ⁵ cellules dans la partie intérieure de la rondelle. Des précautions doivent être prises pour ne pas toucher le tissu avec la pointe de la pipette. Soyez sûr que la goutte de suspension cellulaire reste en place.
3. Placer les tranches avec des cellules dans l'étuve à 37 ° C et 5% de CO ₂ d'au moins 30 minutes pour permettre aux lymphocytes de migrer dans les tissus.

5. Imagerie des cellules T à l'intérieur des tranches de ganglions lymphatiques

Dans cette vidéo, article, nous cellules T d'image fluorescente dans des tranches de ganglions lymphatiques avec un grand champ microscope inversé et un microscope confocal debout.

1. Réglez la température à 37 ° C. Nos microscopes sont équipés de chambres à température contrôlée.
2. Installer un système de perfusion permettant la perfusion continue de la tranche de ganglion lymphatique avec oxygénée (5% de CO _2, 95% d'O ₂₎ rouge de phénol milieu RPMI sans. Dans notre système, perfusé des médias pénètre dans la chambre de l'imagerie d'un côté par la gravité. Le milieu est aspiré par une pompe reliée à un flacon de collecte des déchets. Réglez le débit des médias à 1 ml / min.
3. Avec une pince fine, délicatement enlever la tranche de la plaque de 6 puits et tremper la préparation dans un milieu RPMI réchauffé oxygéné pendant quelques secondes pour se débarrasser des cellules fluorescentes pas infiltré dans le tissu.

ImaGing cellules T avec un microscope à champ large inversé

4. Placez la tranche à l'envers sur une chambre d'imagerie sur mesure qui se compose de fils de nylon collé sur la partie intérieure d'un plat à fond de verre. Dans cette chambre, le fils de nylon d'élever la tranche du verre et de permettre la solution oxygénée à diffuser dans les tissus. Ceci est nécessaire que la migration des lymphocytes T dans les ganglions lymphatiques est fortement dépendante de l'oxygène. Fixez la tranche en ajoutant sur lui une rondelle en acier inoxydable. Dans ces conditions, la tranche se situe à quelques microns au-dessus du fond du plat, ce qui facilite le renouvellement de la solution de perfusion.
5. Pour capturer un grand champ de vision (800 x 800 um, environ un tiers de la surface de trancher le nœud), de recueillir des images en utilisant un objectif 10x à sec. Nous avons constaté que le 10x Nikon S Fluor 0,5 NA était le plus approprié pour nos analyses.

Une expérience d'imagerie time-lapse typiques capte 5 avions optiques couvrant une profondeur totale de 50 um dans le sens axial (z) la dimension. Fluorescent des cellules T sont généralement imagée à des intervalles allant 10 à 30 secondes pendant 10 à 20 min.

Imagerie des cellules T avec un microscope confocal debout

Le microscope confocal utilisé dans ce protocole est un Leica SP5 équipé d'un objectif 20x immersion dans l'eau (l'Olympe, 20x/0.95 NA).

6. Fixez la tranche à l'étape de l'imagerie du microscope. Remarque: En général, nous placer une rondelle sur la préparation pour l'immobiliser.
7. Régler une session d'imagerie en recueillant une série d'images le long de l'axe z. Pour les cellules T d'image dans une structure de tissu intact, la position de départ est généralement fixé à 5 à 10 microns en dessous de la cellule T étiqueté premier.

6. Les résultats représentatifs

En suivant cette vidéo-protocole vous devriez vous attendre à visualiser un grand nombre de cellules T fluorescentes accumulés dans la zone T du nœud, un phénomène qui se produit normalement dans cet environnement particulier in vivo (figure 1). En particulier, les cellules T doivent être exclus des zones de cellules B, qui sont généralement juste en dessous de la capsule. Une expérience réussie se traduira également par les lymphocytes T recrutés dans le tissu (figure 2), en affichant un comportement très mobiles (figure 3) cohérentes avec les résultats publiés obtenus dans les ganglions lymphatiques intactes ^4. En moyenne, la vitesse moyenne de l'individu au sein de cellules T tranches devrait être proche de 10 um / min (figure 4).

Figure 1. Les lymphocytes T s'accumulent dans une tranche de ganglion lymphatique. Marqués à la fluorescence des cellules T (CMFDA, vert) ont été ajoutés à un nœud lymphatique tranche 30 min avant l'acquisition d'image (photo du haut). L'image est la projection maximale de 5 images couvrant 50 microns dans la direction z. L'image en champ clair est indiqué en bas. Les images ont été capturées avec un microscope à champ large.

Figure 2. Les cellules T sont recrutés dans une tranche de ganglion lymphatique. Marqués à la fluorescence des cellules T (CMFDA, vert) ont été ajoutés à un noeud lymphatique tranche de 30 minutes avant l'acquisition d'images en utilisant un microscope confocal. Les images ont été capturées à la surface de coupe (photo du haut) et 40 um ci-dessous (image du bas).

Figure 3. Les cellules T sont très mobiles dans une tranche de ganglion lymphatique. Marqués à la fluorescence des cellules T ont été imagées pendant 12 min à l'aide d'un microscope à champ large. Trajectoires de cellules T individuelles sont affichées sous forme de couleur pistes pour représenter les déplacements croissante du bleu (faible cellules mobiles) au rouge (forte cellules mobiles). Pistes ont été calculés en utilisant le logiciel Imaris. La ligne blanche suit le bord du nœud, tandis que l'ovale pointillé délimite la zone B putatifs cellule.

Figure 4. Dans une tranche de ganglion lymphatique, la vitesse des cellules T est proche de 10 um / min. Les vitesses ont été calculées en utilisant le logiciel à partir des pistes Imaris représenté dans la figure 3.

Discussion

Nous avons décrit une simple technique rapide et robuste pour générer des tranches de ganglions lymphatiques, qui sont utilisées pour étudier le comportement des cellules T introduit. Ces dernières années, cette méthode a été appliquée avec succès à l'aide du thymus et des tranches de ganglions lymphatiques d'identifier les facteurs contrôlant le positionnement extracellulaire des cellules T et la motilité ^1,5. Il a également été utilisé pour mesurer les réponses Ca ^{2 +} dans les thymocytes lors de la sélection positive et dans les cellules T à ^2,6 reconnaissance de l'antigène. Le dosage de tranche de superposition présente des avantages et des limites qui méritent d'être discutés. Fait à noter, ce système permet d'accéder à des tissus, utile si on a besoin de manipuler des tranches pharmacologiquement afin d'interférer avec le contrôle moléculaire de la migration cellulaire. Suite à l'imagerie, les tranches peuvent être traitées pour l'immunohistochimie pour recueillir plus d'informations sur les structures qui ont été imagées. Par ailleurs, l'observation peut être faite avec un microscope à fluorescence à champ large traditionnels. Bien que la résolution n'est pas aussi bonne qu'avec une confocale ou un microscope à deux photons et que la phototoxicité est en principe plus sévère avec un photon à la microscopie à deux photons, il a les avantages de la simplicité, un coût inférieur, et les grands choix de longueurs d'onde d'excitation.

L'imagerie des cellules T dans un ganglion lymphatique intact nécessite l'injection intraveineuse de lymphocytes marqués que par la suite la maison pour les organes lymphoïdes. Comme nous l'avons montré précédemment ^1, le dosage tranche est parfaitement compatible avec l'expérience de transfert adoptif. Toutefois, la longueur du temps nécessaire pour les cellules T à l'accueil dans les ganglions lymphatiques peut compliquer l'utilisation de colorants fluorescents qui ont tendance à s'échapper des cellules au cours du temps. C'est le cas de la Ca ^{2 +} colorant fura-2. Avec le recrutement rapide (<30 min) de cellules T dans les tissus, le dosage tranche fournit une occasion d'utiliser des colorants tels. Enfin, cette méthode a le grand avantage d'analyser les fonctions des cellules T dans plusieurs tissus humains maintenus en vie.

Ce système expérimental présente aussi des limites qui doivent être conservés à l'esprit. Dommages liés à la découpe peut affecter le fonctionnement des cellules T, en particulier dans la région superficielle du tissu près de la surface de coupe. Afin d'évaluer la mort cellulaire dans la tranche, nous avons utilisé le colorant fluorescent SYTOX verte qui pénètre les cellules avec la membrane plasmique compromise. Nos expériences révèlent qu'environ 20% des cellules ganglionnaires au total, principalement localisées dans la région superficielle du tissu, ont été marqués par fluorescence avec ce colorant nucléaire. Un autre problème potentiel avec le test est la capacité des tranches de conserver d'importants facteurs solubles, y compris les chimiokines. Bien, nous n'avons aucune indication que nos données ont été affectés par ces problèmes, car les cellules T affiche une bonne motricité dans la tranche, nous tenons à souligner l'importance de l'imagerie des cellules T dans les régions saines situées à plusieurs dizaines de microns de la surface de coupe. Alors, cela pourrait être fait avec des microscopes traditionnels (grand champ ou confocale), comme dans ce protocole, il est probable que la préparation de tranches du ganglion lymphatique associé à l'imagerie à deux photons va augmenter la résolution spatiale en profondeur et réduire la phototoxicité.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Microscope confocal	Leica	SP5
Vibratome	Leica	VT1200S
Pinces fines	Instruments de précision du monde	14142
30 mm inserts de culture	Millipore	PICM0RG50
RPMI	Invitrogen	61870010	RPMI complet-milieu est faite en ajoutant 10% inactivé à la chaleur sérum de veau foetal et de la pénicilline / streptomycine
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14170088
Basse température de gélification agarose, de type VII-A	Sigma-Aldrich	A0701
Butyl colle cyanoacrylate, Vetbond	3M	1469
Rondelles en acier inoxydable de 4 mm de diamètre intérieur	Magasin de bricolage
Cellule Tracker verte CMFDA	Invitrogen	C7025