Ex-vivo-Imaging von T-Zellen in Murine Lymph Node Slices mit Weitfeld und konfokale Mikroskope

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um Bild fluoreszierenden T-Zellen in Lymphknoten Scheiben eingeführt. Die Technik ermöglicht Echtzeit-Analysen der T-Zell-Migration mit traditionellen Weitfeld-Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskopen.

Zusammenfassung

Naive T-Zellen kontinuierlich Verkehr zu sekundären lymphatischen Organen, einschließlich der peripheren Lymphknoten, um seltene Ausdruck Antigene. Die Migration von T-Zellen in Lymphknoten ist ein komplexer Prozess, der sowohl zelluläre und chemische Faktoren, einschließlich Chemokinen handelt. Kürzlich hat sich der Einsatz von Zwei-Photonen-Mikroskopie erlaubt T-Zellen in intakten Lymphknoten zu verfolgen und daraus einige quantitative Informationen über ihr Verhalten und ihre Interaktionen mit anderen Zellen. Zwar gibt es offensichtliche Vorteile einer in-vivo-System sind, erfordert dieser Ansatz eine komplexe und teure Instrumente und bietet nur begrenzten Zugang zu dem Gewebe. Zur Analyse des Verhaltens von T-Zellen innerhalb von murinen Lymphknoten, haben wir ein Stück Assay ^1, ursprünglich von Neurobiologen gesetzt und vor kurzem auf murine Thymus ^{transponierten 2.} entwickelt. In dieser Technik werden fluoreszenzmarkierten T-Zellen nicht auf eine akut vorbereitet Lymphknoten Scheibe beschichtet. In diesem Video-Beitrag werden die Lokalisierung und die Migration von T-Zellen in das Gewebe in Echtzeit mit einem Weitfeld und einem konfokalen Mikroskop analysiert. Die Technik, die in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie bietet einen effektiven Ansatz zur Bild-T-Zellen in ihrer natürlichen Umgebung und Mechanismen, die T-Zell-Migration aufzuklären ergänzt.

Protokoll

1. Vorbereitung Scheiben von Lymphknoten

1. Bereiten Sie eine 4% niedriger Schmelzpunkt Agarose-Lösung für die Einbettung. Verdünnen Agarose in PBS und Mikrowelle dieser Lösung. Wenn der Agarose vollständig gelöst ist, warten die Lösung bei 37 ° C bis zur Verwendung.
2. Bereiten Sie eine 6-well Gewebekulturplatte. Fügen Sie 1,1 ml RPMI komplettem Kulturmedium pro Vertiefung, und fügen Sie ein organotypischen Filter in jede Vertiefung. Legen Sie die 6-Well-Platte bei 4 ° C bis zu seiner Scheiben übertragen.
3. Legen Sie Unterlegscheiben aus Edelstahl, mit einem Innendurchmesser von 4 mm, in einer Plastikschale mit RPMI komplett gefüllt ist. Unterlegscheiben weiter verwendet werden, um die Zellen auf der Vibratom Anschnitt zu konzentrieren.
4. Sacrifice der Maus in Übereinstimmung mit den örtlichen Tierschutzvorschriften. Entfernen Sie vorsichtig den peripheren Lymphknoten aus dem umgebenden Gewebe und legen Sie sie in einer Plastikschale mit eiskaltem PBS. Es ist darauf zu achten, dass die Lymphknoten Struktur beschädigt werden, da diese Organe sehr weich sind.
5. Gießen Sie die 4%-igen Agarosegel in eine 35-mm-Kunststoff-Schale und zart Übertragung der Knoten in das Gel. Lassen Sie das Agarosegel auf Eis für 5 min zu verhärten.
6. Entfernen Sie den Block aus der Schale und schneiden Sie die Agar um 3-5 mm Gel um jeden Lymphknoten zu verlassen.
7. Befestigen Sie den eingebetteten Knoten auf der Probe Festplatte des Vibratom mit ungiftigen Gewebekleber. Installieren Sie die Probe Festplatte in das Fach mit eiskaltem PBS gefüllt.
8. Section der Agar-eingebetteten Gewebe bei 320 mu m Dicke mit dem Vibratom Geschwindigkeit auf einem langsamen Bereich eingestellt (0,3 mm / s) und die Schwingungsfrequenz auf einem mittleren Bereich (1,5 mm) eingestellt.
9. Sorgfältig Transfer Lymphknoten Scheiben, wie sie sein auf der organotypischen Kultur Inserts mit feinen Pinzetten geschnitten werden. Platz 3 Scheiben auf jeder Einsatz. Seien Sie sehr vorsichtig, als Scheiben leicht beschädigt werden kann. Eine typische periphere Lymphknoten wird Ausbeute 5 Abschnitte, wenn sie bei 320 um geschnitten. Entsorgen Sie die erste und letzte Scheiben, als sie enthalten nur oberflächliche Gewebe.
10. Legen Sie Unterlegscheiben aus Edelstahl auf jedem einzelnen Stück. Stellen Sie sicher, Unterlegscheiben sind auf dem Agarose umgebende Gewebe positioniert.
11. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C in einer 5% CO ₂ befeuchteten Inkubator bis ready-to-Plate-T-Zellen.

2. Isolating T-Zellen aus der Maus Lymphknoten

1. Isolieren T-Zellen nach dem zuvor veröffentlichten JoVE Artikel ^3.
2. Verwenden Sie T-Zellen sofort und gehen zum nächsten Abschnitt. Andernfalls könnte Lymphozyten über Nacht in komplettem RPMI-Medium mit 10 ng / ml IL-7 ergänzt kultiviert werden.

3. Kennzeichnung von isolierten T-Zellen

1. Wash-Zellen in HBSS. Resuspendieren sie in dem gleichen Puffer bei 10 x 10 ⁶ pro ml.
2. Fügen Sie das gleiche Volumen HBSS mit 1 uM Zelle Tracker grünen CMFDA eine endgültige Konzentration von 0,5 uM.
3. Inkubieren Sie die Zellsuspension bei 37 ° C während 5 min. Wash Zellen zweimal mit komplettem RPMI-Medium.
4. Die Zellen in einer Endkonzentration von 10 x 10 ⁶ pro ml in komplettem RPMI-Medium. Diese markierten Zellen werden auf die Scheiben beschichtet werden.

Andere fluoreszierende Farbstoffe als CMFDA könnte auch genutzt werden, aber bedenken Sie, dass diese Moleküle potentiell toxischen oberhalb bestimmter Konzentrationen sind.

4. Plating markierten T-Zellen auf Lymphknoten-Scheiben

1. Entfernen Sie überschüssiges Medium in den inneren Teil der Scheibe mit einer Pipette enthalten. Nicht in das Gewebe trocken werden, die Arbeit schnell bei diesem Schritt.
2. Gently verzichten 10 bis 20 ul markierten T-Zellen, die 1 bis 2 x 10 ⁵ Zellen in den inneren Teil der Scheibe entspricht. Vorsicht ist geboten, um das Gewebe mit der Spitze der Pipette berühren. Achten Sie darauf, dass der Rückgang der Zellsuspension in Ort und Stelle bleibt.
3. Legen Sie die Schnitte mit Zellen im Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO ₂ für mindestens 30 min, damit Lymphozyten in das Gewebe zu migrieren.

5. Imaging-T-Zellen im Lymphknoten Scheiben

In diesem Video-Beitrag, wir Bild fluoreszierenden T-Zellen in Lymphknoten Scheiben mit einem Weitfeld inversen Mikroskop und einem konfokalen Mikroskop aufrecht.

1. Stellen Sie die Temperatur bei 37 ° C. Unsere Mikroskope sind mit kontrollierter Temperatur Kammern ausgestattet.
2. Installieren Sie eine Perfusion System ermöglicht kontinuierliche Perfusion des Lymphknotens Scheibe mit Sauerstoff (5% CO _2, 95% O ₂₎ Phenolrot-freiem RPMI-Medium. In unserem System gibt perfundierten Medien in der Imaging-Kammer von einer Seite durch die Schwerkraft. Das Medium wird mit einer Pumpe verbunden zu einer Sammelstelle Kolben gesaugt. Legen Sie die Medien Durchfluss auf 1 ml / min.
3. Mit feinen Pinzette vorsichtig herausnehmen Scheibe aus dem 6-Well-Platte und tauchen die Vorbereitung in erwärmt Sauerstoff RPMI-Medium für ein paar Sekunden, um loszuwerden, fluoreszierende Zellen nicht in das Gewebe infiltriert.

ImaGing T-Zellen mit einem Weitwinkel-inversen Mikroskop

4. Platzieren Sie die Scheibe nach oben auf eine maßgeschneiderte Imaging Kammer, die von Nylonfäden auf den inneren Teil einer Glasboden Teller geklebt besteht. In dieser Kammer, heben die Nylonfäden die Scheibe aus dem Glas und aktivieren Sie die Sauerstoff-Lösung in das Gewebe diffundieren. Dies ist erforderlich, da T-Zell-Migration in den Lymphknoten ist stark abhängig von Sauerstoff. Befestigen Sie die Scheibe, indem auf sie ein Edelstahl-Unterlegscheibe. Unter diesen Bedingungen liegt die Scheibe wenige Mikrometer über dem Boden der Schale, die Erneuerung der Perfusionslösung erleichtert.
5. Um eine Aufnahme zu großes Sehfeld (800 x 800 um etwa ein Drittel des Knotens Scheibenoberfläche), sammeln Sie Bilder mit einem 10x-Objektiv trocken. Wir fanden, dass die 10x Nikon S fluor 0,5 nA am besten geeignet für unsere Analysen war.

Ein typisches Zeitraffer-Imaging-Experiment erfasst 5 optischen Flächen überspannt eine Gesamttiefe von 50 um in axialer (z) Dimension. Fluorescent T-Zellen sind in der Regel in Abständen zwischen 10 bis 30 Sekunden, während 10 bis 20 min belichtet.

Imaging-T-Zellen mit einem konfokalen Mikroskop aufrecht

Das konfokale Mikroskop im Sinne dieses Protokolls ist ein Leica SP5 mit einem 20x Wasser Immersionsobjektiv (Olympus, 20x/0.95 NA) ausgestattet.

6. Befestigen Sie die Scheibe auf die Bildgebung des Mikroskops. Hinweis: Wir in der Regel statt einer Scheibe auf die Vorbereitung, um es zu fixieren.
7. Set ein bildgebendes Sitzung durch das Sammeln von einer Reihe von Bildern entlang der z-Achse. Um Bild-T-Zellen in intaktem Gewebe-Struktur, ist die Startposition in der Regel bei 5 bis 10 mu m unterhalb der ersten markierten T-Zellen gesetzt.

6. Repräsentative Ergebnisse

Durch Einhalten dieses video-Protokoll sollten Sie erwarten, dass eine große Anzahl von fluoreszierenden T-Zellen in der T-Zone des Knotens, ein Phänomen, das normalerweise in diesem besonderen Umfeld, in vivo (Abbildung 1) angesammelt zu visualisieren. Insbesondere sollte T-Zellen aus B-Zell-Zonen, die in der Regel sind nur unter der Kapsel ausgeschlossen werden. Ein erfolgreiches Experiment wird auch in T-Zellen in das Gewebe (Abbildung 2) rekrutiert Ergebnis und zeigt eine sehr bewegliche Verhalten (Abbildung 3) im Einklang mit publizierten Ergebnissen in intakten Lymphknoten ⁴ erhalten. Im Durchschnitt sollte die mittlere Geschwindigkeit der einzelnen T-Zellen innerhalb von Scheiben in der Nähe von 10 pm / min (Abbildung 4).

Abbildung 1. T-Zellen reichern sich in einem Lymphknoten in Scheiben schneiden. Fluoreszenzmarkierten T-Zellen (CMFDA, grün) zu einem Lymphknoten Scheibe 30 min vor der Bildaufnahme (Bild oben) wurden hinzugefügt. Das Bild ist die maximale Projektion von 5 Bilder für mehr als 50 mu m in z-Richtung. Die Hellfeldbild ist in unten dargestellt. Die Bilder wurden mit einem Weitfeld-Mikroskop aufgenommen.

Abbildung 2. T-Zellen werden in einem Lymphknoten Scheibe rekrutiert. Fluoreszenzmarkierten T-Zellen (CMFDA, grün) zu einem Lymphknoten Scheibe 30 min vor der Bildaufnahme mit einem konfokalen Mikroskop wurden hinzugefügt. Die Bilder wurden an der Schnittfläche (Bild oben) und 40 um unten (Bild unten) erfasst.

Abbildung 3. T-Zellen sind sehr beweglich in einem Lymphknoten in Scheiben schneiden. Fluoreszenzmarkierten T-Zellen während 12 min mit einem Weitfeld-Mikroskop wurden abgebildet. Flugbahnen der einzelnen T-Zellen werden als farbcodierte Tracks angezeigt zu erhöhen Verschiebungen von blau (geringe bewegliche Zellen) bis rot (hoch bewegliche Zellen) repräsentieren. Tracks wurden mit Imaris Software. Die weiße Linie folgt der Kante des Knotens, während die gestrichelten Oval begrenzt die vermeintliche B-Zell-Zone.

Abbildung 4. Innerhalb einer Lymphknoten-Scheibe, wird die T-Zell-Geschwindigkeit in der Nähe von 10 pm / min. Die Geschwindigkeiten wurden mit Imaris Software von Tracks in Abbildung 3 dargestellt.

Diskussion

Wir haben eine einfache, schnelle und robuste Technik zur Erzeugung von Lymphknoten Scheiben, die verwendet werden, um das Verhalten der eingeführten T-Zellen zu untersuchen beschrieben sind. In den letzten Jahren wurde diese Methode erfolgreich angewendet mit Thymus-und Lymphknoten-Scheiben an die extrazelluläre Faktoren, die T-Zell-Positionierung und Beweglichkeit ^1,5 identifizieren. Es wurde auch verwendet, um Ca ^{2 +} Antworten in Thymozyten messen während positive Selektion und in T-Zellen auf Antigen-Erkennung ^2,6. Die Overlay-Scheibe-Test zeigt Vor-und Nachteile, die diskutiert werden sollten. Zu beachten ist, erlaubt dieses System den Zugriff auf das Gewebe, nützlich, wenn man braucht, um Scheiben pharmakologisch zu manipulieren, um mit der molekularen Kontrolle der Zellmigration stören. Im Anschluss an Bildgebung, können die Scheiben für die Immunhistochemie verarbeitet werden, um weitere Informationen über die Strukturen, die abgebildet sind zu sammeln. Darüber hinaus kann die Beobachtung mit einem traditionellen Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop vorgenommen werden. Obwohl die Auflösung nicht so gut wie mit einem konfokalen oder ein Zwei-Photonen-Mikroskop und daß Phototoxizität ist grundsätzlich schwerer mit Ein-Photonen als mit Zwei-Photonen-Mikroskopie, hat es den Vorteil der Einfachheit, niedrigere Kosten und größere Auswahl von Anregungswellenlängen.

Die Abbildung von T-Zellen in einer intakten Lymphknoten erfordert intravenöse Injektion von markierten Lymphozyten, die anschließend nach Hause zu lymphatischen Organen. Wie wir bereits ¹ gezeigt haben, ist die Scheibe Assay vollkommen kompatibel mit adoptiven Transfer zu experimentieren. Allerdings kann die Länge der Zeit für T-Zellen nach Hause in die Lymphknoten notwendig erschweren den Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen, dass eine Tendenz zur Undichtigkeit aus den Zellen im Laufe der Zeit haben. Dies ist der Fall der Ca ^{2 +} Farbstoff Fura-2. Mit der schnellen Rekrutierung (<30 min) von T-Zellen in das Gewebe, bietet die Scheibe Test die Möglichkeit, solche Farbstoffe verwendet werden. Schließlich hat diese Methode den großen Vorteil, auf T-Zell-Funktionen in verschiedenen menschlichen Geweben analysieren am Leben gehalten.

Dieses experimentelle System stellt auch Einschränkungen, die man im Auge behalten werden müssen. Schaden mit dem Schneiden verbundenen beeinflussen können T-Zell-Funktion, vor allem im oberflächennahen Bereich des Gewebes in der Nähe der Schnittfläche. Um Zelltod innerhalb der Schicht zu beurteilen, haben wir den Fluoreszenzfarbstoff SYTOX grün, dass die Zellen dringt mit eingeschränkter Plasmamembran verwendet. Unsere Experimente zeigen, dass etwa 20% der gesamten Knotenpunkt Zellen, meist im oberflächennahen Bereich des Gewebes lokalisiert, fluoreszierend wurden mit diesem nuklearen Farbstoff markiert. Ein weiteres mögliches Problem mit dem Test wird die Fähigkeit der Scheiben, um wichtige lösliche Faktoren wie Chemokine zu behalten. Obwohl wir keinen Hinweis darauf, dass unsere Daten von solchen Problemen betroffen waren, da T-Zellen eine gute Beweglichkeit Anzeige innerhalb der Schicht haben, möchten wir die Bedeutung der bildgebenden T-Zellen in gesunde Regionen an mehreren zehn Mikrometern aus der Schnittfläche befindet Stress. Während diese mit traditionellen Mikroskopen (Weitfeld-oder konfokalen) wie in diesem Protokoll getan werden könnte, ist es wahrscheinlich, dass die Lymphknoten Scheibe Vorbereitung mit Zwei-Photonen-Imaging wird die räumliche Auflösung in der Tiefe zu erhöhen und die Phototoxizität kombiniert.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Konfokalen Mikroskop	Leica	SP5
Vibratom	Leica	VT1200S
Feine Pinzetten	World Precision Instruments	14142
30 mm Kultur-Einsätze	Millipore	PICM0RG50
RPMI	Invitrogen	61870010	Vollständige RPMI-Medium wird durch Zugabe von 10% Hitze-inaktiviertem fetalem Kälberserum und Penicillin / Streptomycin gemacht
Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14170088
Low Geliertemperatur Agarose, Typ VII-A	Sigma-Aldrich	A0701
Butyl Sekundenkleber, Vetbond	3M	1469
Unterlegscheiben aus Edelstahl, 4 mm Innendurchmesser	Baumarkt
Zell-Tracker grünen CMFDA	Invitrogen	C7025