Monitoreo adsorción de proteínas de estado sólido Nanoporos

Resumen

Un método de utilización de estado sólido nanoporos para controlar la adsorción inespecífica de proteínas en una superficie inorgánica se describe. El método emplea el principio de resistencia de pulso, lo que permite la absorción que se probaron en tiempo real y en el nivel de moléculas individuales. Debido a que el proceso de adsorción sola proteína está lejos del equilibrio, se propone el empleo de arrays paralelos de nanoporos sintéticos, lo que para la determinación cuantitativa de la velocidad de reacción aparente de primer orden constante de adsorción de proteínas, así como la constante de Langmuir de adsorción.

Resumen

De estado sólido nanoporos se han utilizado para realizar mediciones en el nivel de moléculas individuales para examinar la estructura local y la flexibilidad de los ácidos nucleicos ^1-6, el despliegue de las proteínas de ^7, y la afinidad de unión de diferentes ligandos ^8. Mediante el acoplamiento de estos nanoporos para la técnica de resistencia de pulso ^9-12, estas mediciones se puede hacer en una amplia variedad de condiciones y sin necesidad de etiquetado ^3. En la técnica de resistencia de pulso, una solución de sal iónica se presenta en ambos lados de la nanopore. Por lo tanto, los iones son expulsados ​​de un lado de la cámara a la otra por un potencial de membrana aplicada, dando lugar a una corriente constante. La partición de un analito en el nanopore causa una deflexión bien definidas en esta corriente, que pueden ser analizados para extraer una sola molécula de la información. Usando esta técnica, la adsorción de proteínas individuales a las paredes nanopore puede ser monitoreado en una amplia gama decondiciones ^13. Adsorción de proteínas está creciendo en importancia, ya que como dispositivos de microfluidos disminuye de tamaño, la interacción de estos sistemas con proteínas individuales se convierte en una preocupación. Este protocolo describe un ensayo rápido para la proteína de unión a las películas de nitruro, que puede extenderse fácilmente a otras películas delgadas susceptibles a la perforación nanopore, ni a las superficies de nitruro de funcionalizado. Una gran variedad de proteínas puede ser explorado en una amplia gama de soluciones y las condiciones de desnaturalización. Además, este protocolo podrá ser utilizado para explorar problemas más básicos de uso de la espectroscopia nanopore.

Protocolo

1. Fabricación de estado sólido nanoporos en las membranas de nitruro de silicio

1. Llevar / la FEI Tecnai F20 S TEM a un voltaje de aceleración de 200 kV. Si se utiliza un diferente S / TEM, la tensión de aceleración debe ser mayor o igual a 200 kV ⁹
2. Carga de 20 nm de espesor de nitruro de silicio SPI cuadrícula de la ventana en el soporte de muestras TEM y limpio, con plasma de oxígeno durante 30 segundos para eliminar los contaminantes de la titular.
3. Cargar la muestra en el S / TEM y permitir que el vacío de la bomba hacia abajo. Una vez que el S / TEM ha bombeado al vacío, encontrar la ventana de nitruro en el modo TEM de campo claro mediante la búsqueda de un cuadrado luminoso en el Ronchigram. Asegúrese de que el TEM se alinea correctamente, alinear y enfocar la muestra.
4. El modificador / S en modo TEM STEM. Utilice el HAADF (o equivalente) detector de la imagen de la muestra y asegúrese de que está correctamente alineado.
5. Establecer el monocromador a un valor bajo. Un valor más bajo del monocromador permite una mayor monedast de electrones disponibles para la perforación. Si la S / TEM no tiene un monocromador, ignore este paso.
6. Seleccione un tamaño de punto apropiado para la perforación de la nanopore. Esto se corresponde con el diámetro de la sonda electrónica. Una sonda de 3 nm funciona bien para la perforación de 5 poros nm de diámetro. Una investigación más grandes (5 mn) a perforar con mayor rapidez y crear un poro más grande. Una sonda más pequeña (1 nm) tomará más tiempo para perforar y crear un poro más pequeño.
7. Ajustar las alineaciones de STEM, si es necesario.
8. El enfoque de la membrana de nitruro y llevarlo a un aumento de x1.3M. Enfoque de precisión debe ser realizado por el control de la Ronchigram.
9. Si hay algún movimiento de la muestra, y luego esperar a que la muestra se estabilice. Esto puede tomar hasta una hora. En blanco el haz de electrones, mientras que espera a fin de no dañar el nitruro.
10. Coloque la sonda de electrones sobre la muestra y comenzar a perforar.
11. Revise periódicamente la muestra mediante el escaneo con el detector de HAADF, tanto para asegurarse de que la nanopore se drilled (que se verá como una mancha oscura) y para comprobar que no hay movimiento de la muestra. Si la muestra se desplaza un poco, ajustar la posición de la sonda electrónica para el nanopore.
12. Vea el Ronchigram para identificar cuando el poro se ha formado. Cuando en el enfoque, la película de nitruro tiene una apariencia brillante. Esto va a desaparecer cuando se forma el nanopore. Poner el Ronchigram ligeramente fuera de foco permite ver una franja de Fresnel asociada con el nanopore.
13. Tomar una imagen de la nanopore con la HAADF.
14. Hacer un perfil de intensidad de la imagen nanopore. El diámetro de la nanopore puede ser estimado por la región más oscura del perfil.
15. Ampliación de la nanopore puede realizar moviendo la sonda de electrones a lo largo de los bordes de los poros.
16. Una vez que el nanopore es del diámetro deseado, poner la S / TEM en modo TEM.
17. Llevar el monocromador a su establecimiento de normas y la imagen de la nanopore utilizando TEM de campo claro para confirmar el tamaño (Fig. 1).

2. Humectación de la nanopore de estado sólido

1. De gas-agua desionizada con 1 M KCl, 10 mM fosfato de potasio, pH 7,4. Esto puede hacerse poniendo las soluciones al vacío y colocarlos en un baño de ultrasonido durante 20 minutos.
2. Coloque el nanopore chip que contiene nitruro de silicio en un vaso de 10 ml Pyrex. Tenga cuidado de no romper la ventana de nitruro ya que es muy delicado. Colocar el vaso en una placa bajo una campana extractora y se puso a 100 ° C.
3. Limpie el chip nanopore con una solución de pirañas con mucho cuidado. Primero se debe agregar 3 ml de ácido sulfúrico en el recipiente con una pipeta de vidrio. A continuación, añadir con cuidado 1 ml de peróxido de hidrógeno en el ácido sulfúrico para hacer una solución de pirañas ^14. Por favor, tomar todas las precauciones.
4. Permita que el chip nanopore en remojo en una solución de pirañas durante 10 minutos.
5. Eliminar la solución de pirañas del vaso con una pipeta de vidrio. Colóquelo en un recipiente de almacenamiento adecuado.
6. Fill el vaso con el de-cámaras de gas, agua desionizada con una pipeta de vidrio limpio. Vaso de agua vacías y repetir por lo menos 5 veces.
7. Retire el chip nanopore con pinzas limpia y seca por succión ligera
8. Inmediatamente, el sello del chip nanopore en la cámara (Fig. 2a, 2b). El chip puede ser asegurado en la cámara por las juntas tóricas o sellador de silicona.
9. Llenar la cámara con una solución de KCl
10. Conectar los electrodos de Ag / AgCl a la cámara (Figura 2b). Electrodos puede ser hecha empapando alambre de plata en la lejía durante la noche.
11. Aplicar un potencial de membrana a través de los electrodos y el seguimiento de la respuesta actual con un axón 200 mil millones de patch-clamp amplificador en el modo de voltaje-clamp.
12. Construir una curva I / V (corriente-voltaje) a partir de las mediciones. La curva I / V debe ser muy lineal cuando se utiliza KCl 1 M (Fig. 3). La conductancia de la nanopore debe corresponder a su diámetro. Si el nanopore no muestra unalineales de E / V de curva, la conductividad es muy baja, o la corriente abierta de la nanopore no es estable (Fig. 4a), que significa que el nanopore no está bien mojado y lavado de pirañas se debe repetir.

3. Monitoreo adsorción de proteínas

1. Es de vital importancia para llevar a cabo experimentos de control con una sola membrana o matriz-nanopore paralelo de nanoporos (ver abajo) para controlar la corriente de las condiciones de amortiguación que carecen de la proteína de la muestra. Le recomendamos los siguientes dos pasos: (i) el uso de una alta pureza a nivel de buffer (pureza> 99,9%, cromatografía de grado), y (ii) el uso de un tampón, cuya interacción con la nanopore de estado sólido no producir un solo canal de eventos. Además, se recomienda la obtención de una muestra de proteína de alta pureza, utilizando los procedimientos estándar de la química de proteínas. La pureza de la muestra de la proteína debe ser revisado por dodecil sulfato-poliacrilamida análisis en gel (SDS-PAGE) y ma de alta resoluciónss espectrometría de ^15.
2. Añadir una muestra purificada de la proteína a estudiar en el baño de tierra de la cámara. Dé tiempo para que la muestra difusa por todo el baño. Las concentraciones típicas de proteína que se puede medir en decenas de nM a la gama M ^7,15-21.
3. Aplicar un sesgo potencial transmembrana voltaje con polaridad opuesta a la de la carga total de la proteína en estudio. Por ejemplo, BSA cuenta con un eficaz carga neta negativa a pH 7,4, y por lo tanto, una tensión de polarización positiva se debe aplicar. El voltaje aplicado crea gradiente de potencial en el interior nanopore y las proteínas de las cargas opuestas se verán impulsadas por fuerzas opuestas. Sólo polaridades de voltaje que conducen a las proteínas en el nanopore creará señales medibles.
4. Un potencial aplicado de magnitud de 200 mV debe ser lo suficientemente grande como para observar la mayoría de los analitos de proteínas. Los eventos aparecen como desviaciones transitorias de la actual línea de base (Fig. 4B).Si no hay señal que se observa, el aumento de la concentración de la proteína en la cámara. Voltajes más altos mejorar la relación señal a ruido. Nanoporos nitruro puede soportar varios voltios.
5. Adsorciones proteína aparecerá como de larga duración cambios en la línea de base actual de la nanopore (Fig. 4C).

4. Posibilidades de funcionalización de los nanoporos

Existen varios métodos para la aplicación de los grupos funcionales de nitruro de silicio ^22,23. La mayoría de las películas de nitruro de una fina capa de óxido en el exterior y la exposición al ozono puede crear una capa de óxido adicional, si es necesario. Organosilanos se pueden utilizar diferentes y la auto-ensamblado en tales capas. De particular interés es aminosilano, que auto-ensambla y se puede modificar aún más (es decir, ácido, ácidos y aldehídos), lo que permite la inspección de una amplia gama de superficies orgánicas. Después de un nanopore se ha lavado con pirañas y se asegura en el Chamber, aminas se pueden añadir directamente a la cámara de baño con un electrolito de soporte de 0,5 M TBACl (tetrabutilamonio) y MeOH anhidro (metanol) se usa como solvente. La formación de monocapa se puede controlar mediante la aplicación de un sesgo de voltaje 400 mV y la medición de los índices actuales de ^23.

5. Determinación de la aparente de primer orden la velocidad de reacción constante y la constante de Langmuir de adsorción utilizando matrices en paralelo nanopore

5.1 El aparente de primer orden las constantes de velocidad de reacción para la absorción y desorción

Hacemos hincapié en que el aspecto positivo de esta metodología es su capacidad de observar adsorciones individuales a nivel de moléculas individuales. Las mediciones de una sola molécula de la adsorción de proteínas sobre una superficie inorgánicos se pueden ampliar mediante el empleo de arrays paralelos de estado sólido nanoporos. La matriz paralela de nanoporos es necesario debido a la necesidad de muchos poros ensayo para obtener estadísticas fiabless. Con este fin, el uso de una amplia nanopore permitiera el seguimiento de adsorciones individuales, así como la medición de múltiples eventos para su posterior análisis. Una serie de nanoporos en el nitruro de silicio puede ser formado por el protocolo anterior, simplemente mediante la perforación de orificios múltiples en la muestra. Cada nanopore deben ser de tamaño similar. Las matrices de nanoporos de 6x6 o 7x7 debe ser adecuada. Tras la adición de analito de proteína en la cámara, la corriente se deteriorará de manera exponencial con la siguiente expresión:

I _t = _∞ I - (I _∞ - I ₀₎ exp (-k t ')

Aquí, _t, denota la corriente en un tiempo t experimental. I ₀ es el paso inicial corriente a través de la matriz nanopore. _∞ I indica la intensidad en el nivel de saturación (es decir, infinito). K 'es la aparente de primer orden la velocidad de reacción constante, lo que puede determinarse a partir ªe ajuste de la curva experimental. A mayor k 'se puede interpretar como una mayor velocidad de absorción. La relación que _∞ / I _0, también llamado la saturación normalizado actual, es un número sin dimensiones entre 0 y 1. Este parámetro es una medida de la ocupación por los analitos de proteínas adsorbidas. Por lo tanto, cada una de las condiciones experimentales distintas debe estar asociado con dos parámetros de salida específica que _∞ / I ₀ y k '.

Cabe señalar que la aparente de primer orden constantes de velocidad de absorción y las corrientes normalizadas son impactados por el tiempo efectivo dedicado por las proteínas dentro de los nanoporos. Este tiempo depende de la concentración de los analitos de proteínas en fase acuosa a granel ^24. Por lo tanto, una corrección adicional de estos números debe aplicarse en base al tiempo efectivo dedicado por las proteínas en el interior nanopore. Le sugerimos medir la frecuencia de las FASt (translocación) eventos y multiplicándolo por el tiempo medio de permanencia de tales eventos. Esto le dará el tiempo promedio de proteínas pasado en el interior nanopore por unidad de tiempo.

La constante de velocidad de desorción se puede determinar mediante una matriz paralela de nanoporos también. Tan pronto como el nivel actual alcanza la saturación (I _∞), la tensión debe ser revertida, por lo que no más proteínas se encuentran atrapados en los nanoporos. Desorción de las proteínas individuales serán acompañados por la alteración de la corriente registró hacia valores mayores. La constante de velocidad se extrae a continuación de la subida del nivel actual.

5.2 La constante de Langmuir de adsorción

La absorción de los analitos de proteínas en las superficies inorgánicas de los nanoporos depende de la concentración de proteínas en fase acuosa. Este fenómeno ya se ha observado a nivel de moléculas individuales ^13. Si θ representan s la corriente de saturación normalizada (I _∞ / I _0), entonces una típica ecuación de Langmuir isoterma está dada por la siguiente expresión:

donde C es la concentración de proteínas en la fase acuosa. α es la constante de adsorción de Langmuir. Esto aumenta la constante con un aumento en la energía de enlace de adsorción y con una disminución de la temperatura. La recogida de los puntos de datos θ se emplean mediciones con matrices paralelas llevadas a cabo en las concentraciones de proteínas diferentes en la fase acuosa. Los datos deben ser analizados en combinación con otras técnicas para verificar la magnitud de la adsorción de Langmuir equipado constante. Además, todo el atomista simulaciones de dinámica molecular ^25,26 también se puede utilizar para ayudar a las interpretaciones de los datos experimentales obtenidos.

título "> 6. Resultados Representante

Los resultados típicos de estado sólido nanoporos será el siguiente. La corriente de poro abierto debe ser muy estable, como se ve en la fig. 4a. El I / V características de la nanopore debe ser muy lineal en KCl 1 M, 10 fosfato de potasio, pH 7,4, como se ve en la fig. 2. La pendiente de un ajuste lineal a la curva I / V proporcionará la conductancia unitaria de la nanopore. La conductancia tiene una relación directa con el diámetro nanopore y debe coincidir con la ecuación: , Donde G es la conductancia de la nanopore, d es su diámetro, l es su longitud, y σ es la conductividad de la solución en la cámara ^14. Este valor debe coincidir con el plazo de 30%. Si es demasiado pequeño, el poro es probable que no mojada. Con la adición de proteínas, eventos rápida debe producirse, como se ve en la fig. 4b. Protein adsorción es una caída de corriente de larga duración como se muestra en la fig. 4c. Algunas proteínas son muy lábiles y se someten a una transformación estructural en el interior de los poros. En este caso, la caída de tensión de larga duración estará acompañado por las rápidas fluctuaciones.

Figura 1. De estado sólido nanopore fabricado con un F20 Tecnai S / TEM. El poro se perforó en modo STEM a un diámetro de 20 nm. La imagen fue tomada en el modo TEM de campo claro. Nitruro fue de 30 nm de espesor.

Figura 2. Cámara utilizada para alojar un único estado sólido nanopore en las mediciones de resistencia de pulso. Una Cámara) y un chip de silicio con ventana de nitruro independiente (rejilla TEM). El nanopore es perforado en el nitruro de antes de la carga. Red O-rings se utilizan para formar una buena seal sobre el chip, que separa dos baños de solución iónica. B) Representación esquemática de la cámara que muestra la ubicación de los baños de solución y los electrodos con respecto a la nanopore.

Figura 3. Típicos de E / V rastros de estado sólido nanoporos de diferentes diámetros. Trazas de un solo canal eléctrico fueron tomadas en 1 M KCl, 20 mM Tris, pH 8,5. Nanoporos fueron perforados en 30 de nitruro de silicio nm de espesor. Nota de nitruro de espesor afectará la conductancia unitaria de la nanopore.

Figura 4. Medida de un solo canal trazas actuales y la detección de la adsorción de proteínas. A) Un rastro de un solo canal eléctrico que indica la corriente abierta de un diámetro de 10 nm nanopore. B) las desviaciones actuales representan la partición de albúmina de suero bovino (BSA) en el interior de la nanopore. C) La adsorción de BSA sobre la superficie de nitruro de silicio. Todos los restos son de la misma nanopore en KCl 1 M, fosfato de potasio 10 mM, pH 7,4. El potencial de membrana se aplicó 40 mV y BSA se añadió al baño de la cámara conectada a tierra en una concentración de 120 nM.

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Discusión

Espontánea de adsorción de las proteínas en estado sólido de superficies ^27-29 es de fundamental importancia en una serie de áreas, como las aplicaciones biochip y el diseño de una nueva clase de biomateriales híbridos funcionales. Estudios previos han demostrado que las proteínas adsorbidas a las superficies de estado sólido no muestran la movilidad lateral o tasas significativas de desorción, y por lo tanto la adsorción de proteínas generalmente se considera un proceso irreversible y no específ...

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Materiales

Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tecnai F20 S / TEM	FEI		S / TEM requiere fuente de voltaje de aceleración ≥ 200kV y de emisión de campo.
20 nm de espesor de nitruro de silicio para TEM membrana de la ventana	SPI	4163SN-BA
Axón Axopatch 200 mil millones de patch-clamp amplificador	Molecular Devices
Axón Digidata 1440A	Molecular Devices
pCLAMP 10 software	Molecular Devices		Electrofisiología de Adquisición de Datos y Análisis de Software
Ácido sulfúrico	Fclasificador Científico	A300
peróxido de hidrógeno	Fisher Scientific	H325
silicona las juntas tóricas	McMaster-Carr	003 S70	Alternativamente, puede utilizar PDMS
alambre de plata	Sigma-Aldrich	348759	Para los electrodos
SPC Tecnología, D-sub de contacto, pin	Newark	9K4978	Para los electrodos
cloruro de potasio	Sigma	P9541
fosfato de potasio dibásico	Sigma	P2222
fosfato de potasio monobásico	Sigma	P5379
PDMS	Dow Corning		Sylgar 184 Elastomer conjunto. Para la toma de la cámara.
Kwik-Cast sellador	Mundial de Instrumentos de Precisión	KWIK-CAST	Rápida actuación de silicona sellante
plato caliente	Fisher Scientific
Jaula de Faraday