Surveillance des protéines par adsorption à semi-conducteurs Nanopores

Résumé

Une méthode d'utilisation de l'état solide nanopores pour surveiller l'adsorption non-spécifique de protéines sur une surface inorganique est décrite. La méthode utilise le principe résistif impulsion, permettant à l'adsorption à sonder en temps réel et à la molécule seul niveau. Parce que le processus d'adsorption est seule protéine loin de l'équilibre, nous proposons l'emploi de réseaux parallèles de nanopores de synthèse, permettant pour la détermination quantitative du taux de réaction de premier ordre apparent constant de l'adsorption des protéines ainsi que l'adsorption de Langmuir et les constantes.

Résumé

Solid-state nanopores ont été utilisés pour effectuer des mesures au niveau molécule unique d'examiner la structure locale et la flexibilité des acides nucléiques ^1-6, le déroulement des protéines ^7, et l'affinité de liaison des ligands différents ^8. En couplant ces nanopores à la technique résistive impulsion ^9-12, de telles mesures peut être faite sous une grande variété de conditions et sans la nécessité d'un étiquetage ^3. Dans la technique résistive impulsions, une solution de sel ionique est introduite des deux côtés de la nanopore. Par conséquent, les ions sont entraînés par un côté de la chambre à l'autre par un potentiel transmembranaire appliquée, résultant en un courant stable. Le partitionnement d'un analyte dans le nanopore provoque une déviation bien définie dans ce courant, qui peuvent être analysés pour en extraire une seule molécule d'informations. En utilisant cette technique, l'adsorption de certaines protéines sur les parois nanopore peut être contrôlé dans une large gamme deconditions ^13. L'adsorption des protéines gagne en importance, parce que les dispositifs microfluidiques diminuer en taille, l'interaction de ces systèmes avec des protéines unique devient une préoccupation. Ce protocole décrit un test rapide pour la protéine de liaison à des films de nitrure, qui peut être facilement étendu à d'autres films minces se prêtent au forage nanopore, ou sur des surfaces de nitrure fonctionnalisés. Une variété de protéines peuvent être explorés dans une large gamme de solutions et de conditions de dénaturation. En outre, ce protocole peut être utilisé pour explorer plus de problèmes de base en utilisant la spectroscopie nanopore.

Protocole

1. Fabrication de semi-conducteurs nanopores dans des membranes de nitrure de silicium

1. Apportez de la FEI Tecnai F20 S / TEM à une tension d'accélération de 200 kV. Si vous utilisez un autre S / TEM, la tension d'accélération doit être supérieure ou égale à 200 kV ⁹
2. Chargez une 20 nm d'épaisseur de silicium de grille SPI fenêtre de nitrure dans le porte-échantillon TEM et nettoyer avec un plasma d'oxygène pendant 30 secondes pour éliminer tous les contaminants de la titulaire.
3. Chargez l'échantillon dans le S / TEM et de permettre le vide à la pompe vers le bas. Une fois que le S / TEM a pompé vers le vide, trouver la fenêtre de nitrure en mode TEM champ lumineux en recherchant un carré lumineux sur le Ronchigram. Assurez-vous que le TEM est correctement aligné, puis alignez et concentrer l'échantillon.
4. Le commutateur / s en mode TEM STEM. Utilisez le HAADF (ou équivalent) à l'image de détecteur de l'échantillon et s'assurer qu'il est correctement aligné.
5. Régler le monochromateur à une valeur faible. Une valeur inférieure du monochromateur permet une plus grande Current d'électrons disponibles pour le forage. Si le S / TEM n'a pas de monochromateur, ignorez cette étape.
6. Sélectionnez une taille de spot approprié pour percer le nanopore. Cela correspond au diamètre de la sonde électronique. Une sonde de 3 nm fonctionne bien pour le forage de 5 nm de diamètre des pores. Un plus grand capteur (5 nm) forera plus rapidement et de créer une plus grande porosité. Une petite sonde (1 nm) prendra plus de temps à percer et à créer un petit pore.
7. Régler les alignements STEM, si nécessaire.
8. Axer la membrane de nitrure et l'amener à un grossissement de x1.3M. Mise au point fine devrait être fait par le suivi de la Ronchigram.
9. S'il n'y a aucun mouvement de l'échantillon, puis d'attendre l'échantillon à se stabiliser. Cela peut prendre jusqu'à une heure. Blank le faisceau d'électrons dans l'attente afin de ne pas endommager le nitrure.
10. Placer la sonde d'électrons sur l'échantillon et de commencer le forage.
11. Vérifier périodiquement l'échantillon par balayage avec le détecteur HAADF à la fois pour s'assurer que le nanopore est drilled (il ressemble à une tache sombre) et de vérifier qu'il n'ya pas de mouvement de l'échantillon. Si l'échantillon dérives légèrement ajuster la position de la sonde électronique d'être sur le nanopore.
12. Regarder le Ronchigram de déterminer quand le pore a formé. Lorsque la mise au point, le film de nitrure a une apparence chatoyante. Cette disparaîtra lorsque les formes nanopore. Mettre le Ronchigram légèrement floue permet de voir une frange de Fresnel associé à la nanopore.
13. Prenez une image de la nanopore avec le HAADF.
14. Ne un profil d'intensité de l'image nanopore. Le diamètre de la nanopore peut être estimée par la région la plus sombre du profil.
15. L'élargissement de l'nanopore peut être réalisée en déplaçant la sonde électronique le long des bords du pore.
16. Une fois le nanopore est le diamètre désiré, mettre le S / TEM en mode TEM.
17. Apportez le monochromateur à son réglage standard et l'image de la nanopore utilisant champ lumineux TEM pour confirmer la taille (Fig. 1).

2. Le mouillage de la nanopore l'état solide

1. De-gaz de l'eau déminéralisée contenant 1 M de KCl, phosphate de potassium 10 mM, pH 7,4. Cela peut être fait en mettant les solutions sous vide et en les plaçant dans un bain d'ultrasons pendant 20 minutes.
2. Placez le nanopore puce contenant du nitrure de silicium dans un bécher de 10 ml en Pyrex. Prenez soin de ne pas briser la fenêtre de nitrure car il est très délicat. Placer le bécher sur une plaque chauffante sous une hotte et mettre à 100 ° C.
3. Nettoyez la puce avec une solution piranha nanopore en utilisant le plus grand soin. D'abord, ajoutez 3 ml d'acide sulfurique dans le récipient à l'aide d'une pipette en verre. Ensuite, ajouter prudemment une peroxyde d'hydrogène ml à l'acide sulfurique pour préparer une solution piranha ^14. S'il vous plaît prendre toutes les précautions.
4. Permettre à la puce nanopore à tremper dans une solution piranha pendant 10 minutes.
5. Retirer la solution piranha du bécher à l'aide d'une pipette en verre. Placez-le dans un récipient de stockage approprié.
6. FiLL le bécher avec le dégazée, de l'eau déminéralisée à l'aide d'une pipette de verre propre. Bécher vide d'eau et de répéter au moins 5 fois.
7. Retirer la puce nanopore avec des pincettes propre et la sécher par aspiration de lumière
8. Immédiatement, le sceau de la puce nanopore dans la chambre (fig. 2a, 2b). La puce peut être fixée dans la chambre par des joints toriques ou de mastic silicone.
9. Remplir la chambre avec une solution de KCl
10. Brancher les électrodes Ag / AgCl à la chambre (fig. 2b). Électrodes peuvent être faites par trempage dans l'eau de Javel fil d'argent pendant la nuit.
11. Appliquer un potentiel transmembranaire à travers les électrodes et de surveiller la réponse actuelle à l'aide d'un axone 200B amplificateur de patch-clamp dans le mode de voltage-clamp.
12. Construire une courbe I / V (courant-tension) à partir des mesures. La courbe I / V doit être extrêmement linéaire lorsque vous utilisez 1 M KCl (fig. 3). La conductance de la nanopore doit correspondre à son diamètre. Si le nanopore n'affiche pas unlinéaire I / V courbe, la conductance est trop faible, ou le courant de l'ouverture nanopore n'est pas stable (figure 4a), cela signifie que le nanopore n'est pas correctement mouillée et laver piranha doit être répété.

3. Surveillance d'adsorption des protéines

1. Il est extrêmement important de réaliser des expériences de contrôle avec une seule membrane-nanopore ou un tableau parallèle des nanopores (voir ci-dessous) pour contrôler le courant avec les conditions de tampon manquant l'échantillon de protéine. Nous vous recommandons les deux étapes suivantes: (i) l'utilisation d'une grande pureté au niveau du tampon (pureté> 99,9%; chromatographie-grade de niveau), et (ii) l'utilisation d'un tampon dont l'interaction avec le nanopore l'état solide ne produire un seul canal d'événements. En outre, nous recommandons d'obtenir un échantillon de protéines de haute pureté en utilisant les procédures standard en chimie des protéines. La pureté de l'échantillon de protéine devrait être vérifié par le sodium dodécyl sulfate-polyacrylamide analyse sur gel (SDS-PAGE) et haute résolution MAss spectrométrie ^15.
2. Ajouter un échantillon de la protéine purifiée d'être étudié dans le bain de la chambre de la terre. Prévoyez du temps pour l'échantillon à diffuser dans le bain. Les concentrations typiques des protéines qui peuvent être mesurés sont dans les dizaines de nm à large uM ^7,15-21.
3. Appliquer une tension de polarisation transmembranaire potentiel avec polarité opposée à celle de la charge totale de la protéine étudiée. Par exemple, BSA a une efficacité charge nette négative à pH 7,4, et donc une tension de polarisation positive doit être appliquée. La tension appliquée crée gradient de potentiel à l'intérieur nanopore et des protéines de charges opposées seront conduits par des forces opposées. Seuls les polarités de tension qui alimentent les protéines dans le nanopore va créer des signaux mesurables.
4. Un potentiel appliqué de grandeur de 200 mV doit être suffisamment grand pour observer les analytes plus de protéines. Evénements apparaîtra comme passagère déflexions courant de la ligne de base (figure 4b).Si aucun signal n'est observé, augmenter la concentration de la protéine dans la chambre. Des tensions plus élevées d'améliorer le rapport signal sur bruit. Nanopores Nitrure peut résister à plusieurs volts.
5. Adsorptions protéines apparaissent comme de longue durée des changements dans la ligne de base actuelle de la nanopore (figure 4C).

4. Les possibilités de fonctionnalisation de la nanopores

Il existe plusieurs méthodes pour appliquer des groupes fonctionnels au nitrure de silicium ^22,23. La plupart des films de nitrure ont une mince couche d'oxyde sur l'extérieur et l'exposition à l'ozone peut créer une couche d'oxyde supplémentaire, si nécessaire. Organosilanes différentes peuvent être utilisées et l'auto-assemblés sur de telles couches. D'intérêt particulier est aminosilane, qui s'auto-assemble et peuvent être modifiés supplémentaires (par exemple, d'acides carboxyliques et les aldéhydes), permettant à l'inspection d'une gamme de surfaces organiques. Après un nanopore a été lavé à l'piranha et sécurisé dans le Chamber, amine peut être ajouté directement dans le bain de la chambre avec un électrolyte support de 0,5 M TBACl (tétrabutylammonium) et MeOH anhydre (méthanol) utilisé comme solvant. La formation de monocouches peuvent être surveillés par l'application d'une tension de 400 mV biais et la mesure de la baisse actuelle ^23.

5. Détermination de la vitesse de réaction apparente de premier ordre constant et la constante de Langmuir adsorption utilisant des tableaux nanopore parallèles

5.1 L'apparente de premier ordre constantes de vitesse de réaction pour l'absorption et de désorption

Nous soulignons que l'aspect positif de cette méthode est sa capacité à observer adsorptions individu au niveau d'une seule molécule. Les mesures à molécule unique d'adsorption des protéines sur une surface inorganique peut être étendu en utilisant des tableaux en parallèle de l'état solide nanopores. Le tableau parallèle des nanopores est nécessaire en raison de la nécessité de pores de nombreux test pour obtenir des statistiques fiabless. À cette fin, l'utilisation d'un tableau nanopore permettrait le suivi des adsorptions individuels ainsi que la mesure d'événements multiples pour une analyse ultérieure. Un tableau de nanopores dans le nitrure de silicium peut être formée par le protocole ci-dessus par simple perçage de trous multiples dans l'échantillon. Chaque nanopore devrait être de taille similaire. Les tableaux de nanopores de 6x6 ou 7x7 devrait être suffisant. Lors de l'addition de l'analyte protéique dans la chambre, le courant se désintègre d'une façon exponentielle avec une expression suivante:

Je _t = _∞ I - (I _∞ - I ₀₎ exp (-k t ')

Ici, je _t, désigne le courant à un instant t expérimentales. I ₀ est l'origine de passage de courant à travers le tableau nanopore. Je _∞ indique le courant au niveau de la saturation (c'est à dire, l'infini). K 'est la vitesse apparente de réaction de premier ordre constante, ce qui peut être déterminé à partir de ee ajustement de la courbe expérimentale. Une plus grande k 'peut être interprété comme un rythme plus rapide d'adsorption. Le rapport I / _∞ I _0, appelée aussi la saturation normalisées actuelles, est un nombre sans dimension entre 0 et 1. Ce paramètre est une mesure de l'occupation par les analytes protéine adsorbée. Par conséquent, chaque condition expérimentale distincte devrait être associé à deux paramètres de sortie spécifique, je _∞ / I ₀ et k '.

Il est à noter que l'apparente du premier ordre constantes de vitesse d'adsorption et de courants normalisés sont touchés par le temps effectif consacré par les protéines dans les nanopores. Ce temps est dépendant de la concentration des analytes protéines en phase aqueuse en vrac ^24. Par conséquent, la correction supplémentaire de ces chiffres doit être mise en œuvre basée sur le temps effectif consacré par les protéines à l'intérieur nanopore. Nous vous suggérons de mesurer la fréquence du SAFt (translocation) des événements et en le multipliant par le temps de séjour moyen de tels événements. Cela vous donnera le temps moyen passé de protéines à l'intérieur nanopore par unité de temps.

Le taux constant de désorption peut être déterminée en utilisant un réseau parallèle de nanopores ainsi. Dès que le niveau actuel arrive à saturation (I _∞), la tension doit être inversée, donc pas plus de protéines sont piégés dans les nanopores. La désorption des protéines individuelles seront accompagnés par l'altération du courant enregistrés vers une plus grande valeur. La constante de vitesse sera ensuite extrait de la hausse du niveau actuel.

5.2 La constante d'adsorption de Langmuir

L'absorption d'analytes protéines sur les surfaces inorganiques de l'nanopores est dépendante de la concentration de protéines en phase aqueuse. Ce phénomène a déjà été observée à la molécule seul niveau ^13. Si θ représente s le courant de saturation normalisé (I / _∞ I _0), puis une équation de Langmuir typiques isotherme est donnée par l'expression suivante:

où C est la concentration en protéines dans la phase aqueuse. α est la constante de Langmuir adsorption. Cette augmentation constante avec une augmentation de l'énergie de liaison de l'adsorption et à une diminution de la température. La collecte des points de données θ emploiera des mesures avec des tableaux parallèles effectuées à des concentrations de protéines différentes en phase aqueuse. Les données doivent être analysées en combinaison avec d'autres techniques pour vérifier l'ampleur de la constante d'adsorption de Langmuir équipée. De plus, plein atomistique simulations de dynamique moléculaire ^25,26 pourrait être également utilisé pour aider les interprétations des données obtenues expérimentale.

titre "> 6. résultats représentatifs

Les résultats typiques pour l'état solide nanopores sera comme suit. Le courant à pores ouverts doivent être très stables, comme on le voit dans la Fig. 4a. Les caractéristiques I / V de la nanopore devrait être très linéaire dans 1 M de KCl, 10 phosphate de potassium, pH 7,4, comme on le voit dans la Fig. 2. La pente de un ajustement linéaire de la courbe I / V fournira la conductance unitaire du nanopore. La conductance a un rapport direct avec le diamètre nanopore et doit correspondre à l'équation: , Où G est la conductance de la nanopore, d est son diamètre, l est sa longueur, et σ est la conductivité de la solution dans la chambre ^14. Cette valeur doit correspondre à moins de 30%. Si elle est trop petite, votre pores n'est probablement pas mouillé. Avec plus de protéines, d'événements rapides devraient s'ensuivre, comme on le voit dans la Fig. 4b. Protein adsorption est une baisse de longue durée en cours tel qu'il apparaît dans la Fig. 4c. Certaines protéines sont hautement instables et subissent des transformations structurelles dans l'intérieur des pores. Dans ce cas, la chute de tension longue durée de vie sera accompagné par des fluctuations rapides.

Figure 1. Solid-state nanopore fabriqué en utilisant une F20 Tecnai S / TEM. Le pore a été foré en mode STEM d'un diamètre de 20 nm. L'image a été prise en mode TEM champ lumineux. Nitrure était de 30 nm d'épaisseur.

Figure 2. Chambre utilisés pour le logement d'une seule semi-conducteurs dans le nanopore résistifs à impulsions mesures. Une chambre) et une puce de silicium avec une fenêtre de nitrure autoportants (grille TEM). Le nanopore est foré dans le nitrure de avant le chargement. Rouge joints toriques sont utilisés pour former une bonne sEAL sur la puce, qui sépare deux bains de solution ionique. B) Schéma de la chambre montrant le placement des bains de solution et des électrodes par rapport à la nanopore.

Figure 3. Typique I / V des traces pour l'état solide nanopores de différents diamètres. Traces monocanal électriques ont été prises dans 1 M de KCl, 20 mM Tris, pH 8,5. Nanopores ont été forés dans 30 nitrure de silicium nm d'épaisseur. Épaisseur de nitrure Remarque aura une incidence sur la conductance unitaire du nanopore.

Figure 4. Mesuré à canal unique trace actuelle et la détection de l'adsorption des protéines. A) Une trace monocanal électrique montrant le courant ouvert d'un nanopore 10 nm de diamètre. B) la flèche actuelle représente le partitionnement d'albumine sérique bovine (BSA) dans l'interIOR de l'nanopore. C) L'adsorption de BSA sur la surface de nitrure. Toutes les traces sont de la même nanopore 1 M KCl, phosphate de potassium 10 mM, pH 7,4. Le potentiel transmembranaire appliquée était 40 mV et BSA a été ajouté au bain de chambre à la terre à une concentration de 120 nM.

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Discussion

Spontanée adsorption des protéines sur des surfaces semi-conducteurs ^{de 27 à 29} est fondamentalement important dans un certain nombre de domaines, tels que les applications de biopuces et la conception d'une nouvelle classe de biomatériaux hybrides fonctionnels. Des études antérieures ont montré que les protéines adsorbées sur des surfaces semi-conducteurs ne montrent pas la mobilité latérale ou les taux de désorption significative, et donc l'adsorption des protéines est généralement co...

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matériels

Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires
Tecnai F20 S / TEM	FEI		S / TEM nécessite source de tension d'accélération ≥ 200kV et à émission de champ.
20 nm d'épaisseur fenêtre de membrane de nitrure de silicium pour le TEM	SPI	4163SN-BA
Axon Axopatch 200B amplificateur de patch-clamp	Molecular Devices
Axon Digidata 1440A	Molecular Devices
pClamp 10 logiciels	Molecular Devices		Électrophysiologie Acquisition de données et d'analyse du logiciel
L'acide sulfurique	FIsher scientifique	A300
peroxyde d'hydrogène	Fisher Scientific	H325
toriques en silicone	McMaster-Carr	003 S70	Sinon, utiliser le PDMS
fil d'argent	Sigma-Aldrich	348759	Pour les électrodes
CPS technologie, D sous contact, broches	Newark	9K4978	Pour les électrodes
chlorure de potassium	Sigma	P9541
phosphate de potassium dibasique	Sigma	P2222
phosphate de potassium monobasique	Sigma	P5379
PDMS	Dow Corning		Sylgar 184 Elastomer ensemble. Pour faire la chambre.
Kwik-Cast Mastic	Instruments de précision du monde	KWIK-CAST	Rapide mastic silicone agissant
plaque chauffante	Fisher Scientific
Cage de Faraday