Мониторинг белка адсорбция с помощью полупроводниковых нанопор

Резюме

Метод с использованием полупроводниковых нанопор для контроля неспецифической адсорбции белков на поверхности неорганические описывается. Метод использует резистивный импульса принципу, что позволяет адсорбции быть проверены в режиме реального времени и в одиночных молекул уровне. Потому что процесс адсорбции одного белка далека от равновесия, мы предлагаем работу параллельных массивов синтетических нанопор, что позволяет для количественного определения очевидной реакцией первого порядка константа скорости адсорбции белка, а также и адсорбции Ленгмюра постоянной.

Аннотация

Твердотельные нанопор были использованы для выполнения измерений на одной молекулы уровне изучить локальную структуру и гибкость нуклеиновые кислоты ^1-6, разворачивается белков ⁷ и сродство различных лигандов ^8. Объединяя эти нанопор на резистивная-импульсной техники ^9-12, таких измерений может быть сделано при самых разнообразных условиях и без необходимости маркировки ^3. В активно-импульсной техники, ионные солевой раствор вводится по обе стороны нанопор. Таким образом, ионы приводятся в движение с одной стороны камеры на другую применяется трансмембранного потенциала, в результате чего постоянный ток. Разбиение аналита в нанопор причины четко определенные отклонения в этом ток, который может быть проанализирован для извлечения одной молекулы информации. Используя эту технику, адсорбции одного белков нанопор стен можно наблюдать в широком диапазонеусловий ^13. Белки адсорбции приобретает все большее значение, поскольку, как микрожидкостных устройств уменьшаться в размерах, взаимодействие этих систем с одной белков становится проблемой. Этот протокол описывает быстрый тест для связывания с белками для пленок нитрида, который может быть легко распространена на другие тонкие пленки поддаются бурения нанопор, или функциональными поверхности нитрида. Разнообразие белков можно изучить под широкий спектр решений и денатурирующих условиях. Кроме того, этот протокол может быть использован для изучения более основных проблем с использованием нанопористых спектроскопии.

протокол

1. Производство полупроводниковых нанопор в мембранах из нитрида кремния

1. Принесите / TEM FEI Tecnai F20 S для ускорения напряжением 200 кВ. При использовании различных S / TEM, ускоряющее напряжение должно быть больше или равна 200 кВ ⁹
2. Нагрузка 20 нм SPI нитрида кремния окно сетку в ТЭМ держателя образца и чистым кислородом плазмы в течение 30 секунд, чтобы удалить любые загрязнения из держателя.
3. Нагрузка образца в S / TEM и позволяют вакуум насоса вниз. Как только S / TEM имеет откачивалась до вакуума, найти окно в нитрида светлого поля TEM режима, глядя на яркий квадрат на Ronchigram. Убедитесь в том, ТЕМ выровнена должным образом, то выровнять и сосредоточиться образца.
4. Переключатель S / TEM в STEM режиме. Используйте HAADF (или эквивалент) детектор изображения образец и убедитесь, что он правильно выровнен.
5. Установить Монохроматор к низкой стоимости. Меньшее значение Монохроматор позволяет высшее валютамт электронов доступными для бурения. Если S / TEM не указал Монохроматор, пропустите этот шаг.
6. Выберите подходящий размер места для бурения нанопор. Это соответствует диаметр электронного зонда. 3 нм зонд хорошо работает для бурения 5 поры нм в диаметре. Больше зонда (5 нм) будет сверлить быстрее и создавать большие поры. Меньшего зонда (1 нм) займет больше времени, чтобы развернуть и создать меньшие поры.
7. Отрегулируйте STEM трассы, если это необходимо.
8. Фокус нитрида мембраны и довести его до увеличения x1.3M. Точной фокусировки должно быть сделано путем мониторинга Ronchigram.
9. Если есть движение образца, то ждать образец стабилизироваться. Это может занять до часа. Пустые электронного пучка в ожидании, чтобы не повредить нитрида.
10. Место электронного зонда на образец и начать бурение.
11. Периодически проверяйте образец при сканировании с детектором HAADF, и чтобы убедиться, что нанопор в настоящее время DRIlled (он будет выглядеть как темное пятно) и убедиться, что нет никакого движения образца. Если образец дрейфует чуть-чуть, отрегулировать положение электронного зонда быть старше нанопор.
12. Часы Ronchigram определить, когда пора уже сформирован. Когда в фокусе, нитрид фильм мерцающий вид. Это будет исчезать, когда формы нанопор. Ввод Ronchigram немного не в фокусе позволяет увидеть Френеля бахромой связанные с нанопор.
13. Возьмите образ нанопор с HAADF.
14. Есть ли интенсивность профиля нанопор изображения. Диаметр нанопор может быть оценена по темной области профиля.
15. Расширение нанопор может быть выполнена путем перемещения электронного зонда по краям пор.
16. После нанопоры имеет желаемого диаметра, положить S / TEM в режиме TEM.
17. Принесите Монохроматор его стандартов и изображения нанопор использованием светлого поля TEM для подтверждения размера (Рис. 1).

2. Смачивание твердого нанопор

1. Де-газ де-ионизированной воды, содержащей 1 М KCl, 10 мМ фосфата калия, рН 7,4. Это можно сделать, поставив решений в условиях вакуума и размещения их в ванну sonicator течение 20 минут.
2. Место нанопор содержащих чип нитрида кремния в стакан 10 мл Pyrex. Будьте осторожны, чтобы не сломать нитрида окна, как это очень деликатный. Место стакан на плите в вытяжной шкаф и установить до 100 ° C.
3. Чистая нанопор чип с пираньи решения с использованием большой осторожностью. Сначала добавьте 3 мл серной кислоты в контейнер с помощью стеклянной пипетки. Затем, осторожно добавляют 1 мл перекиси водорода в серную кислоту, чтобы пираньи решение ^14. Пожалуйста, примите все меры предосторожности.
4. Разрешить нанопор чип, чтобы отдохнуть в пираньи раствор на 10 минут.
5. Удалить пираньи раствор из стакана с помощью стеклянной пипетки. Поместите его в надлежащий сосуд хранения.
6. Fiбуду стакан с дегазированным, де-ионизированной воды с помощью чистой пипетки стекла. Пустой стакан воды и повторить не менее 5 раз.
7. Удалить нанопор чип с чистым пинцетом и высушить его светом всасывания
8. Сразу же, печать нанопор чип в камеру (рис. 2а, 2б). Чип может быть обеспечено в камере уплотнительные кольца или силиконовым герметиком.
9. Заполнить камеру с KCl решение
10. Подключите Ag / AgCl электродов камеры (рис. 2б). Электроды могут быть сделаны путем замачивания серебряной проволоки в отбеливателя в одночасье.
11. Применить трансмембранного потенциала между электродами и контролировать текущий ответ, используя Axon 200B патч-зажим усилителя напряжения зажим режиме.
12. Построить I / V (ток-напряжение) кривая из измерений. I / V кривая должна быть очень линейным при использовании 1 М KCl (рис. 3). Проводимость нанопор должно соответствовать его диаметру. Если нанопор не отображаетлинейные I / V кривая, проводимость является слишком низкой, или открытые текущие из нанопор не является стабильным (рис. 4а), это означает, что нанопоры должным образом не смачивается и пираньи мытье следует повторить.

3. Мониторинг адсорбции белка

1. Крайне важно провести контрольные эксперименты с одной нанопор мембраны или параллельный массив нанопор (см. ниже) для контроля тока с буфером условиях отсутствия белка образца. Мы рекомендуем следующие два этапа: (я) использование высокой чистоты на уровне буфера (чистота> 99,9%; хромато-класса уровня), и (II), использование буфера, взаимодействие которых с твердотельными нанопор не производство одноканальных событий. Кроме того, мы рекомендуем получения высокой чистоты белка примера с использованием стандартных процедур химии белка. Чистота белка образец должен быть проверен додецилсульфата натрия-полиакриламид (SDS-PAGE) анализ гель и высоким разрешением, масс-спектрометрии ^15.
2. Добавить очищенный образец белка для изучения в заземленной ванне камеры. Подождите, пока образец диффузного всей ванне. Типичные концентрации белка, который может быть измерен в десятки нМ до мкМ диапазоне ^7,15-21.
3. Применить трансмембранный потенциал напряжения смещения с полярностью противоположном суммарный заряд белка изучается. Например, BSA имеет эффективный отрицательный заряд при рН 7,4, и, следовательно, положительное напряжение смещения должны применяться. Приложенное напряжение создает градиент потенциала внутри нанопор интерьера и белков разноименных зарядов будет зависеть от противоположных сил. Только напряжение полярности, которые управляют белки в нанопор создаст измеримое сигналов.
4. Приложенного потенциала величины 200 мВ должно быть достаточно большим, чтобы наблюдать наиболее аналитов белка. События будут выглядеть как переходный ток отклонения от базовой линии (рис. 4б).Если сигнал не наблюдается, увеличение концентрации белка в камере. Высшее напряжение улучшить отношение сигнал-шум. Нитрид нанопор может выдержать несколько вольт.
5. Белки адсорбции появится как долгоживущие изменения в базовый ток нанопор (рис. 4в).

4. Возможности для функционализации нанопор

Там существует несколько методов для применения функциональных групп нитрида кремния ^22,23. Большинство пленок нитрида имеют тонкий слой окисла на улицу и воздействию озона может создать дополнительный слой оксида, если это необходимо. Различные органосиланы могут быть использованы и самоорганизующихся на такие слои. Особый интерес представляет аминосиланом, который самостоятельно собирает и могут быть изменены в дальнейшем (например, карбоновых кислот и альдегидов), что позволяет для проверки ряда органических поверхностей. После нанопор были промывают пираний и закреплены в chambeт, аминов могут быть добавлены непосредственно в камере ванны с фонового электролита 0,5 М TBACl (тетрабутиламмония) и безводного метанола (метанола), используемого в качестве растворителя. Однослойные образование можно контролировать с помощью применения 400 мВ напряжение смещения и измерения тока падение ^23.

5. Определение очевидной первого порядка константы скорости реакции и адсорбции Ленгмюра постоянном использовании параллельных массивы нанопор

5,1 очевидной реакцией первого порядка константы скорости поглощения и десорбции

Мы подчеркиваем, что положительным моментом этой методики является возможность наблюдать отдельные адсорбции на одной молекулы уровне. Одной молекулы белка измерения адсорбции на поверхности неорганические могут быть расширены за счет использования параллельных массивов полупроводниковых нанопор. Параллельный массив нанопор необходимо из-за необходимости анализа многих поры получить достоверную статистикуs. В связи с этим, использование массива нанопор позволит мониторинга отдельных адсорбции, а также измерения нескольких событий для дальнейшего анализа. Массив нанопор в нитрида кремния могут быть образованы путем выше протокол просто бурение нескольких отверстий в образце. Каждый нанопор должны быть такого же размера. Массивы нанопоры 6x6 или 7x7 должна быть адекватной. После добавления белка вещества в камере, ток будет распад в геометрической прогрессии с следующее выражение:

Я _т = I _∞ - (I _∞ - Я ₀₎ ехр (-к т ')

Здесь я _т, обозначает ток при экспериментальных т времени. Я ₀ является оригинальной тока, проходящего через нанопоры массива. I _∞ указывает ток на уровень насыщения (то есть, бесконечность). К 'очевидной первого порядка скорость реакции константа, которая может быть определена из йэлектронной приступе экспериментальной кривой. Больше к 'можно интерпретировать как более быстрыми темпами, адсорбции. Отношение I _∞ / I _0, которая также называется нормированный ток насыщения, является безразмерным числом между 0 и 1. Этот параметр является мерой размещение адсорбированной аналитов белка. Таким образом, каждая отдельная экспериментальная условие должно быть связано с двумя конкретными выходными параметрами I _∞ / I ₀ и к '.

Следует отметить, что очевидная первого порядка константы скорости адсорбции и нормированных токов подвергаются воздействию эффективной время, проведенное белков внутри нанопор. Это время зависит от концентрации белка аналитов в натуральном водной фазы ^24. Таким образом, дополнительная коррекция этих чисел нужно реализовать основанные на эффективное время, проведенное белков в интерьере нанопор. Мы предлагаем измерения частоты ФАСт (транслокация) событий и умножив его на среднем времени пребывания таких событий. Это даст среднее время белки провел в нанопор интерьера в единицу времени.

Константа скорости десорбции можно определить, используя параллельный массив нанопор, а также. Как только текущий уровень достигает насыщения (I _∞), напряжение должно быть отменено, так что никаких больше белков оказались в ловушке в нанопор. Десорбции отдельных белков будет сопровождаться изменением записал ток в сторону большей ценности. Константа скорости будет потом извлечь из роста текущего уровня.

5,2 Ленгмюра адсорбции постоянной

Поглощение белка аналитов на неорганические поверхности нанопор зависит от концентрации белка в водной фазе. Это явление уже наблюдается в одиночных молекул уровне ^13. Если θ представляют с нормированный ток насыщения (I _∞ / I _0), то типичные изотермы Лэнгмюра уравнение задается следующим выражением:

где С-концентрация белка в водной фазе. α является Ленгмюра адсорбции постоянной. Эта константа возрастает с увеличением энергии адсорбции и с понижением температуры. Коллекция θ точек данных будет использовать измерения с параллельным массивов осуществляется при различных концентрациях белка в водной фазе. Данные должны быть проанализированы в комбинации с другими методами для проверки величины установлены постоянная Ленгмюра адсорбции. Кроме того, полный атомистической молекулярной динамики ^25,26 могут быть также использованы для интерпретации полученных экспериментальных данных.

Название "> 6. представителю Результаты

Типичные результаты для полупроводниковых нанопор будет выглядеть следующим образом. Открыть текущий поры должны быть очень стабильными, как показано на рис. 4а. I / V характеристики нанопор должны быть очень линейным в 1 М KCl, 10 фосфата калия, рН 7,4, как показано на рис. 2. Наклон линейной нужным I / V кривая обеспечит унитарного проводимость нанопор. Проводимости имеет прямого отношения к нанопор диаметром и должна соответствовать уравнению: , Где G является проводимость нанопор, г является его диаметр, л-его длина, а σ-проводимость раствора в камере ^14. Это значение должно соответствовать с точностью до 30%. Если он слишком мал, ваши поры, скорее всего, не смачивается. С добавлением белка, быстрые события должны наступить, как видно на рис. 4б. ProtЭйн адсорбции долгоживущих текущего падения, как показано на рис. 4с. Некоторые белки очень лабильной и пройти структурные преобразования в поры интерьер. В этом случае долгоживущих падение напряжения будет сопровождаться быстрым колебаниям.

Рисунок 1. Твердотельные нанопор изготовлены с использованием Tecnai F20 S / TEM. Пор была пробурена в режиме STEM диаметром 20 нм. Снимок был сделан в ярких поля ТЕМ режиме. Нитрид составила 30 нм.

Рисунок 2. Палаты для жилищного одном твердотельным нанопор в резистивных импульса измерений.) Палаты и кремниевый чип с свободно стоящих нитрида окна (TEM сетки). Нанопор бурится в нитрида перед загрузкой. Красный уплотнительные кольца используются для формирования хорошего сEAL о чип, который разделяет две ванны ионных решение. B) Схема камеры показывающие размещение решение ванн и электродов по отношению к нанопор.

Рисунок 3. Типичные I / V следов для полупроводниковых нанопор разного диаметра. Одноканальный электрических следы были доставлены в 1 М KCl, 20 мМ Трис, рН 8,5. Нанопоры были пробурены в 30-нм нитрида кремния. Обратите внимание, толщина нитрид повлияет унитарного проводимость нанопор.

Рисунок 4. Измеренные одноканальный текущего следы и обнаружение белка адсорбции.) Одноканального электрических следа показывает открытые ток 10 нанопор диаметром нм. В) Текущая отклонения представляют разбиения бычьего сывороточного альбумина (БСА) в томIOR из нанопор. C) Адсорбция BSA на поверхности нитрида. Все следы от того же самого нанопор в 1 М KCl, 10 мМ фосфата калия, рН 7,4. Применяется трансмембранный потенциал был +40 мВ и BSA был добавлен в заземленной камеры бане при концентрации 120 нМ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Спонтанное адсорбции белков на твердотельных поверхностях ^27-29 принципиально важно в ряде областей, таких как биочип приложений и проектирование нового класса функциональных биоматериалов гибрид. Предыдущие исследования показали, что белки, адсорбированных на твердотельной по...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
Tecnai F20 S / TEM	FEI		S / TEM требует ускорения напряжения ≥ 200kV и полевых источников выбросов.
Толщиной 20 нм нитрида кремния мембраны окна для ПЭМ	SPI	4163SN-BA
Axon Axopatch 200B патч-зажим усилителя	Molecular Devices
Axon DIGIDATA 1440A	Molecular Devices
pCLAMP 10 программное обеспечение	Molecular Devices		Электрофизиология сбора данных и программное обеспечение для анализа
Серная кислота	FНаучно isher	A300
перекись водорода	Fisher Scientific	H325
силиконовые уплотнительные кольца	McMaster-Carr	003 S70	Кроме использования PDMS
серебряной проволоки	Sigma-Aldrich	348759	Для электродов
НПФ Технология, D-Sub контакт, контакт	Ньюарк	9K4978	Для электродов
хлористый калий	Сигма	P9541
фосфата калия двухосновный	Сигма	P2222
фосфат калия однозамещенный	Сигма	P5379
PDMS	Dow Corning		Sylgar 184 Elastomer множество. Для изготовления камеры.
Kwik-Cast герметик	Инструменты Всемирной Precision	KWIK-CAST	Быстродействующий силиконовый герметик
плитке	Fisher Scientific
Экранированная камера