ソリッドステートナノ細孔を持つ監視タンパク質吸着

要約

無機表面へのタンパク質の非特異的吸着を監視するための固体ナノ細孔を用いる方法が説明されています。方法は、リアルタイムで、単一分子レベルで検出対象にする吸着を可能に、抵抗パルスの原理を採用しています。単一タンパク質吸着のプロセスがはるかに平衡からなので、我々は同様にタンパク質吸着の定数見かけ一次反応速度の定量測定と一定のラングミュア吸着のために可能にする、合成ナノ細孔の並列配列の雇用を提案する。

要約

ソリッドステートナノ細孔は、局所構造と柔軟性核酸^1-6、タンパク質⁷の展開、および異なるリガンド⁸の結合親和性を調べるために、単一分子レベルでの測定を実行するために使用されている。 ^9月12日の抵抗のパルステクニックにこれらのナノ細孔を結合することによって、そのような測定は、様々な条件の下でとラベリング³を必要とせずに行うことができます。抵抗 - パルス法では、イオン性塩溶液は、ナノ細孔の両側に導入されています。したがって、イオンは定常電流、その結果、適用される膜内外電位差によってチャンバの一方から他方に駆動されています。ナノ細孔への分析対象物の分割は、単一分子情報を抽出するために分析することができる、この電流で明確に定義されたたわみを、引き起こす。このテクニックを使用して、ナノ細孔壁への単一のタンパク質の吸着は、広い範囲の下で監視することができます条件^13。マイクロ流体デバイスのサイズが縮小として、単一のタンパク質とこれらのシステムの相互作用が問題となるので、タンパク質の吸着は、重要性が高まっています。このプロトコルは、容易にナノ細孔の掘削の影響を受けやすい他の薄膜、するか、官能窒化物の表面に拡張することができる窒化膜への結合タンパク質の迅速なアッセイについて説明します。タンパク質の様々なソリューションと変性条件の広い範囲で検討されることがあります。また、このプロトコルは、ナノ細孔の分光法を用いてより多くの基本的な問題を探求するために使用されることがあります。

プロトコル

1。シリコン窒化膜の固体ナノ細孔の製造

1. 200 kVの加速電圧にFEI Tecnai F20のS / TEMをもたらす。別のS / TEMを使用している場合、加速電圧はkVの⁹より200以上でなければなりません
2. TEM試料ホルダに20nmの厚SPI窒化ケイ素のウィンドウのグリッドをロードして、ホルダーからの汚染物質を取り除くために30秒間酸素プラズマでクリーニング。
3. S / TEMにサンプルをロードし、真空排気する真空を可能にする。 S / TEMは真空下に励起されると、Ronchigramで明るい正方形を探すことで明視野TEMモードでの窒化物のウィンドウを見つける。 TEMが適切に配置され、その後、サンプルを調整し、焦点を当てることを確認してください。
4. STEMモードにS / TEMを切り替えます。画像にサンプルをHAADF（または同等の）検出器を使用し、それが適切に配置されていることを確認します。
5. 低い値にモノクロメータを設定します。モノクロメータの値が小さいほど、高いオン電を可能に掘削のための利用可能な電子のt。 S / TEMがモノクロメータを持っていない場合、この手順を無視してください。
6. ナノ細孔をあけるための適切なスポットサイズを選択してください。これは、電子プローブの直径に相当する。 3nmのプローブは、5 nmの直径の孔を掘削に適しています。大きなプローブ（5 nm）は、より迅速にドリルと大きな細孔が作成されます。小型プローブ（1 nm）は小さい孔をドリルダウンし、作成に時間がかかります。
7. 必要に応じて、STEMのアライメントを調整します。
8. 窒化膜を集中し、x1.3Mの倍率にそれをもたらす。微動フォーカスはRonchigramを監視することによって行われる必要があります。
9. サンプルのいずれか動きがある場合は、その後安定するまでサンプルを待ちます。これは時間かかることがあります。窒化物を損傷しないように待っている間に電子ビームをブランク。
10. サンプルの電子プローブを配置し、掘削を開始。
11. 定期的にHAADF検出器を走査することによってサンプルをチェックし、両方のナノ細孔は、DRIをされていることを確認するlled（それはダークスポットのようになります）とサンプルのない動きがないことを確認する。サンプルがわずかに変化した場合、ナノ細孔を介してに電子プローブの位置を調整します。
12. 細孔が形成されているときに識別するためRonchigramをご覧ください。ときに、フォーカスで、窒化膜は、輝く外観を持っています。これは、ときにナノ細孔のフォームを非表示になります。焦点が少しRonchigramを出すことは、1つは、ナノ細孔に関連付けられているフレネルフリンジを確認することができます。
13. HAADFによるナノ細孔の画像を取る。
14. ナノ細孔の画像の強度プロファイルを実行してください。ナノ細孔の直径は、プロファイルの最も暗い領域を見積もることができます。
15. ナノ細孔の拡大は、細孔の縁に沿って電子プローブを移動させることによって行なうこともできます。
16. ナノ細孔が所望の直径のものであると、TEMモードにS / TEMを置く。
17. サイズを確認するために、明視野TEMを用いたナノ細孔は、その標準的な設定と画像にモノクロメータをもたらす（図1）。

2。固体ナノ細孔の湿潤

1. 1 MのKCl、10mMリン酸カリウム、pH7.4を含む脱ガス脱イオン水。これは、真空下でのソリューションを配置し、20分間入浴ソニケーターにそれらを置くことによって行うことができます。
2. 10ミリリットルパイレックスビーカーにナノ細孔を含むシリコン窒化チップを置きます。それは非常にデリケートであるため、窒化ウィンドウを壊さないように注意してください。ドラフト内でホットプレート上でビーカーを置き、100℃に設定
3. 細心の注意を使用してピラニア溶液とナノ細孔チップを清掃してください。最初のガラスピペットを用いて容器に3mlの硫酸を加える。次に、慎重にピラニア溶液^14を作るために硫酸を1 mlの過酸化水素を加える。すべての対策を必ず行ってください。
4. ナノ細孔チップは10分間ピラニア溶液に浸漬することができます。
5. ガラスピペットを用いてビーカーからピラニア溶液を取り外します。適切な保管容器にそれを置きます。
6. Fiのきれいなガラスピペットを用いて脱ガス処刑、脱イオン水でビーカーにしよう。空の水のビーカーと少なくとも5回を繰り返します。
7. 清潔なピンセットでナノ細孔チップを取り外し、光吸引によってそれを乾燥させる
8. すぐに、チャンバー（図2a、図2b）にナノ細孔チップを封止し。チップがO -リングまたはシリコーンシーリング材でチャンバー内に確保されることがあります。
9. KCl溶液でチャンバーを埋める
10. チャンバー（図2b）に銀/塩化銀電極を接続してください。電極が一晩漂白剤に銀線を浸漬することによって行うことができる。
11. 電極間の膜電位を印加し、電圧クランプモードで軸索200Bパッチクランプアンプを使用して、現在の応答を監視します。
12. 測定結果から、I / V（電流 - 電圧）曲線を構築する。 1 M塩化カリウム（図3）を使用する場合のI / V曲線は直線性の高いはずです。ナノ細孔のコンダクタンスはその直径に対応する必要があります。ナノ細孔は表示されない場合リニアなI / V曲線、電気伝導度が低すぎる、またはナノ細孔の開いて電流が安定していない場合（図4a）、それはナノ細孔が適切に濡れていないとピラニアの洗浄を繰り返す必要があることを意味します。

3。モニタリングタンパク質吸着

1. それは、タンパク質試料を欠くバッファー条件で電流を監視するために、シングルナノ細孔膜またはナノ細孔の並列配列（下記参照）で制御実験を行うために非常に重要です。我々は、次の2つの手順をお勧めします。（i）高純度レベルでのバッファの使用（純度> 99.9％、クロマトグラフィーグレードのレベル）、および（ii）相互作用の固体ナノ細孔を持つバッファの使用はしないシングルチャネルのイベントを生成します。さらに、我々は標準的なタンパク質化学の手順を使用して高純度のタンパク質試料を取得することをお勧めします。タンパク質試料の純度は、ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミド（SDS - PAGE）ゲル分析により確認されるべきであると高解像度ミリアンペアSS分析法^15。
2. チェンバーの接地バスに検討されるタンパク質の精製サンプルを追加。お風呂全体に拡散するサンプルの時間を許可する。測定可能なタンパク質の典型的な濃度はμM範囲^7,15-21に数十nmにある。
3. 研究されているタンパク質の総電荷量のそれに逆極性で貫通潜在的な電圧のバイアスを適用します。例えば、BSAは、pH7.4で効果的な正味の負電荷を持つため、正電圧のバイアスを適用する必要があります。印加電圧は、反対勢力によって駆動される反対の電荷のナノ細孔内部および蛋白質内で電位勾配が作成されます。ナノ細孔中にタンパク質を駆動するだけの電圧極性は、測定可能な信号を作成します。
4. 200 mVの大きさの印加される電位は、ほとんどの蛋白質の分析対象物を観察するのに十分な大きさでなければなりません。イベントは、ベースラインからの過渡電流の偏向角（図4b）として表示されます。シグナルが観察されていない場合は、チャンバー内のタンパク質の濃度を増加させる。より高い電圧は、信号対雑音比を改善する。窒化物ナノ細孔が数ボルトに耐えることができます。
5. タンパク質の吸着は、ナノ細孔（図4c）の現在のベースラインで長寿命の変化として表示されます。

4。ナノ細孔の機能化の可能性

窒化ケイ素^22,23に官能基を適用するためのメソッドがいくつか存在する。必要に応じて最も窒化膜の外側とオゾンへの曝露上に薄い酸化物層を持っていると、追加の酸化物層を作成することができます。異なる有機シランを使用し、そのような層の上に自己組み立てることができます。特に興味深いのは、有機表面の範囲の検査を可能にする、自己 - 組み立てと（すなわち、カルボン酸とアルデヒド）をさらに改変することができる、アミノシランである。ナノ細孔は、ピラニアで洗浄し、chambeに確保された後R、アミンを溶媒として使用される0.5 M TBACl（テトラブチルアンモニウム）および無水MeOH（メタノール）の支持電解質とチャンバー槽に直接添加することができます。単層の形成は、400mVの電圧バイアスと電流ドロップ²³の測定のアプリケーションによって監視することができます。

5。見かけ上一次反応速度定数の決定と平行ナノ細孔の配列を使用して定数ラングミュア吸着

吸脱着5.1見かけの一次反応速度定数

我々は、この方法論の肯定的な側面は、単一分子レベルでの個々のadsorptionsを観察する能力であることを強調する。無機表面へのタンパク質吸着の単一分子測定は、固体ナノポアの平行配列を採用することによってスケールアップすることができます。ナノ細孔の並列配列は、信頼性の高統計を得るためにアッセイ多くの細孔に必要性が必要であるS.この目的のために、ナノ細孔配列の使用は、個々のadsorptionsのモニタリングだけでなく、さらなる分析のために複数のイベントの測定を可能にするであろう。窒化ケイ素のナノ細孔の配列は、単にサンプル中の複数の穴をあけることによって、上記のプロトコルによって形成されることがあります。それぞれのナノ細孔は、同じようなサイズである必要があります。 6x6のまたは7 × 7のナノ細孔の配列で十分です。チャンバー内のタンパク質の分析対象物を添加すると、現在は次の式で指数関数的に減衰します。

I _T = _I∞ - _（I∞ - I _0）はexp（- K't）は

ここで、I _T、実験的な時刻 tでの電流を示します。I _0は、ナノ細孔配列を介して元流れる電流です。 私は _∞（つまり、無限大）飽和レベルの電流を示す。K'は見かけの一次反応速度です。目から決定することができる、一定のeは、実験曲線のフィット。より大きなkは "速い吸着速度と解釈することができます。比_I∞/ I _0は 、また、正規化された飽和電流と呼ばれる0と1の間の無次元数である。このパラメータは、吸着したタンパク質の分析対象物によって占有の尺度です。したがって、それぞれの別個の実験条件は_、I∞/ I ₀とk'は二つの特定の出力パラメータに関連付けられている必要があります。

それは、見かけの一次の吸着速度定数と正規化電流はナノ細孔内のタンパク質によって費やされる効果的な時間によって影響されることに留意すべきである。この時間は、バルク水相²⁴中のタンパク質の分析物の濃度に依存しています。したがって、これらの数値の追加補正は、ナノ細孔内部に蛋白質によって費やされる効果的な時間に基づいて実装する必要があります。我々は、FASの周波数を測定することを提案T（転座）イベントなどのイベントの平均滞留時間を掛ける。これは、単位時間あたりのナノ細孔内部に費やしたタンパク質の平均時間を与える。

脱離の速度定数は同様にナノ細孔の並列配列を用いて決定することができる。とすぐに現在のレベルが飽和して_（I∞）に達すると、電圧を逆にする必要があるので、これ以上のタンパク質は、ナノ細孔にトラップされていません。個々のタンパク質の脱離が大きい値に向かって記録電流の変化を伴うことになります。速度定数は、現在のレベルの上昇から抽出されます。

5.2ラングミュア吸着定数

ナノ細孔の無機表面へのタンパク質の分析物の吸収は、水相中のタンパク質濃度に依存しています。この現象は、すでに単一分子レベル¹³で観察されている。 θは表している場合の正規化された飽和電流は_（I∞/ I _0）、その後、典型的なラングミュア等温式は次式で与えられます。

ここで、Cは、水相中のタンパク質濃度である。αはラングミュア吸着定数である。吸着の結合エネルギーの増加とと温度の低下に伴って、この定数が増加する。 θのデータポイントのコレクションは、水相中の様々なタンパク質の濃度で実施した並列配列で測定を採用します。データは、フィットラングミュア吸着定数の大きさを確認するために他の技術と組み合わせて分析する必要があります。さらに、フル原子分子動力学シミュレーション^25,26は、得られた実験データの解釈を助けるために使用される場合があります。

タイトル"> 6。代表的な結果

固体ナノ細孔の代表的な結果は次のようになります。開孔電流は図に見られるように、非常に安定している必要があります。 4A。ナノ細孔のI / V特性は、1 M塩化カリウム、 図に見られる10リン酸カリウム、pH7.4の、非常に直線的でなければなりません。 2。 I / V曲線の直線近似の傾きは、ナノ細孔の単位コンダクタンスを提供します。コンダクタンスは、ナノ細孔径には直接的な関係を有しており、方程式と一致する必要があります。 、Gは、ナノ細孔のコンダクタンスであるここで、dはその直径であり、lはその長さであり、σはチャンバ¹⁴内の溶液の導電率である。この値は30％以内に一致する必要があります。それが小さすぎる場合、あなたの気孔はおそらく湿らされていません。タンパク質の追加により、迅速なイベントは、 図に見られるように、結果として起きるはず。 4B。 PROTアイン吸着は、 図に表示されている寿命の長い現在のドロップです。 4C。いくつかのタンパク質は非常に不安定と細孔内部に構造的な変革を受けるている。このケースでは、長寿命の電圧降下は、急激な変動を伴うことになります。

図1。Tecnai F20のS / TEMを用いて作製した固体ナノ細孔 。細孔は、直径20nmにSTEMモードで掘削された。画像は、明視野TEMモードで撮影された。窒化物は、厚さ30nmであった。

図2。商工会議所は、住宅用の抵抗パルス測定における単一固体ナノ細孔を使用する。）商工会議所とフリースタンディング窒化物ウィンドウ（TEMグリッド）とシリコンチップ。ナノ細孔は、ロードする前に、窒化物中に掘られている。レッドO -リングは良いのを形成するために使用されていますイオン溶液の2つのバスを分離チップ、約EAL。ナノ細孔を基準にして解決のお風呂と電極の配置を示す室のB）の回路図。

図3。異なる直径の固体ナノ細孔のためのI / V（通常）のトレース。シングルチャネルの電気トレースは、1 MのKCl、20 mMトリス、pH 8.5で撮影した。ナノ細孔は、厚さ30nmの窒化シリコンで掘削された。 （注）の窒化物の厚さはナノ細孔の単位コンダクタンスに影響を与えます。

図4シングルチャネル電流トレースとタンパク質吸着の検出を測定。）10nmの直径のナノ細孔の開いている現在を示す単一チャネルの電気トレース。 B）現在の偏向角の間にウシ血清アルブミン（BSA）のパーティショニング表現ナノ細孔のIOR。 C）BSAの吸着は、窒化物の表面に。すべてのトレースは、1 MのKCl、10mMリン酸カリウム、pH7.4中に同じナノ細孔からです。適用される膜電位は+40 mVであったとBSAは、120 nMの濃度で接地室のバスに追加されました。

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ディスカッション

固体表面へのタンパク質の自発的な吸着^27-29などのバイオチップのアプリケーションと機能的なハイブリッド生体材料の新しいクラスの設計などの分野の数が、根本的に重要である。これまでの研究では、固体表面に吸着した蛋白質は、横方向の移動性または重要な脱着率が表示されないことが示されているため、タンパク質の吸着は、一般的に不可逆と非特異的なプロセス^30か?...

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資料

試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
Tecnai F20 S / TEM	FEI		S / TEMの加速電圧≥200kVと電界放射源が必要です。
TEM用20nmの厚さの窒化シリコン膜のウィンドウ	SPI	4163SN - BA
軸索Axopatch 200Bパッチクランプアンプ	分子デバイス
軸索Digidata 1440A	分子デバイス
10ソフトウェアをpCLAMP	分子デバイス		電気生理学データ収集と解析ソフトウェア
硫酸	Fisherサイエンティフィック	A300
過酸化水素	フィッシャーサイエンティフィック	H325
シリコンO -リング	マクマスター、カー	003 S70	またPDMSを使用
銀線	シグマアルドリッチ	348759	電極の
SPC技術、Dサブ接点、ピン	ニューアーク	9K4978	電極の
カリウム塩化	シグマ	P9541
リン酸カリウム二塩基	シグマ	P2222
一塩基性リン酸カリウム	シグマ	P5379
PDMS	ダウコーニング		Sylgar 184 Elastomerセット。チャンバーを作るための。
クイックキャストのシーラント	世界の精密機器	KWIK - CAST	速断シリコーンシーリング材
ホットプレート	フィッシャーサイエンティフィック
ファラデー箱