Monitoraggio delle proteine ​​con a stato solido Nanopori

Riepilogo

Un metodo di utilizzo allo stato solido nanopori per monitorare la non-specifico di assorbimento delle proteine ​​su una superficie inorganica viene descritta. Il metodo impiega il resistivo impulsi principio, consentendo l'assorbimento di essere sondato in tempo reale e al livello di singola molecola. Poiché il processo di assorbimento delle proteine ​​singolo è lontano dall'equilibrio, proponiamo l'impiego di matrici parallele di nanopori sintetici, permettendo per la determinazione quantitativa del primo ordine apparente velocità di reazione costante assorbimento di proteine, nonché e il Langmuir adsorbimento costante.

Abstract

A stato solido nanopori sono stati utilizzati per eseguire misure a livello di singola molecola per esaminare la struttura locale e la flessibilità degli acidi nucleici ^1-6, lo svolgimento delle proteine ^​​7 e affinità di legame di ligandi diversi ^8. Accoppiando questi nanopori alla tecnica resistivo impulsi ^9-12, tali misure può essere effettuata sotto una grande varietà di condizioni e senza la necessità di etichettatura ^3. Nel resistivo impulsi tecnica, una soluzione di sale ionico viene introdotto su entrambi i lati del nanoporo. Pertanto, gli ioni sono guidate da un lato all'altro della camera all'altra da un potenziale transmembrana applicata, determinando una corrente costante. Il partizionamento di un analita nel nanoporo provoca una deflessione ben definito in questa corrente, che possono essere analizzati per estrarre singola molecola informazioni. Utilizzando questa tecnica, l'adsorbimento di singole proteine ​​alle pareti nanoporo può essere monitorato con una vasta gamma dicondizioni ^13. Delle proteine ​​è sempre più importante, perché come dispositivi microfluidici ridursi in dimensione, l'interazione di questi sistemi con le proteine ​​singolo diventa un problema. Questo protocollo descrive un test rapido per la proteina legante ai film nitrati, che possono facilmente essere estesa ad altri film sottili suscettibili di foratura nanoporo, o di nitruro di superfici funzionalizzate. Una varietà di proteine ​​può essere esplorato in un'ampia gamma di soluzioni e condizioni di denaturazione. Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato per esplorare più problemi di base utilizzando la spettroscopia nanoporo.

Protocollo

1. Produzione di stato solido nanopori nelle membrane di nitruro di silicio

1. Portare la FEI Tecnai F20 S / TEM ad una tensione di accelerazione di 200 kV. Se si utilizza un diverso S / TEM, la tensione di accelerazione deve essere maggiore o uguale a 200 kV ⁹
2. Carica un 20 nm di spessore SPI griglia di nitruro di silicio finestra nel porta-campione TEM e pulite, con plasma di ossigeno per 30 secondi per rimuovere eventuali contaminanti dal supporto.
3. Caricare il campione in S / TEM e consentire la pompa a vuoto verso il basso. Una volta che il S / TEM ha pompato fino a vuoto, la finestra di nitruro di trovare in campo chiaro modo TEM cercando un quadrato luminoso sul Ronchigram. Assicurarsi che il TEM è allineato correttamente, quindi allineare e mettere a fuoco il campione.
4. Accendere il S / TEM in modalità STEM. Utilizzare il (o equivalente) HAADF rivelatore per l'immagine del campione e assicurarsi che sia correttamente allineata.
5. Impostare il Monocromatore ad un valore basso. Un valore inferiore del Monocromatore consente una maggiore valutet degli elettroni disponibili per la foratura. Se S / TEM non ha un monocromatore, ignorare questo passaggio.
6. Selezionare una dimensione appropriata posto per la foratura del nanoporo. Ciò corrisponde al diametro della sonda di elettroni. A 3 nm sonda funziona bene per la foratura 5 pori di diametro nm. Una sonda più grande (5 nm) si punta in modo più rapido e creare un poro più grande. Una sonda più piccola (1 nm) ci vorrà più tempo per perforare e creare un poro più piccolo.
7. Regolare gli allineamenti STEM, se necessario.
8. Attenzione la membrana di nitruro e portarlo a un ingrandimento di x1.3M. Messa a fuoco bene dovrebbe essere fatto attraverso il monitoraggio della Ronchigram.
9. Se c'è qualche movimento del campione, quindi attendere che il campione si stabilizzi. Questo può richiedere fino a un'ora. Vuoto il fascio di elettroni in attesa in modo da non danneggiare il nitruro.
10. Posizionare la sonda di elettroni sul campione e iniziare foratura.
11. Controllare periodicamente il campione attraverso la scansione con il rivelatore HAADF, sia per assicurarsi che il nanoporo viene drilled (sembrerà una macchia scura) e per controllare che non vi è alcun movimento del campione. Se il campione si sposta leggermente, regolare la posizione della sonda di elettroni ad essere il nanoporo.
12. Guarda il Ronchigram per identificare quando il poro è formato. Quando a fuoco, il film di nitruro ha un aspetto luccicante. Questo scompare quando le forme nanoporo. Mettere il Ronchigram leggermente fuori fuoco permette di vedere una frangia Fresnel associata alla nanoporo.
13. Prendete un'immagine del nanoporo con il HAADF.
14. Fare un profilo di intensità dell'immagine nanoporo. Il diametro del nanoporo può essere stimato dalla regione più scura del profilo.
15. L'allargamento del nanoporo può essere eseguita spostando la sonda di elettroni lungo i bordi del poro.
16. Una volta che il nanoporo è del diametro desiderato, posizionare la S / TEM in modo TEM.
17. Portare il Monocromatore l'impostazione standard e l'immagine del nanoporo con campo chiaro TEM per confermare la dimensione (Fig. 1).

2. Bagnatura a stato solido nanoporo

1. De-gas acqua deionizzata contenente 1 M KCl, 10 mM di potassio fosfato, pH 7,4. Questo può essere fatto mettendo le soluzioni sotto vuoto e mettendoli in un bagno sonicatore per 20 minuti.
2. Posizionare il nanoporo contenenti chip di nitruro di silicio in un bicchiere da 10 ml Pyrex. Fare attenzione a non rompere la finestra di nitruro di quanto è molto delicato. Porre il becher su piastra in una cappa aspirante e impostare a 100 ° C.
3. Pulire il chip nanoporo con soluzione piranha con grande cura. In primo luogo aggiungere 3 ml di acido solforico al contenitore con una pipetta di vetro. Successivamente, con attenzione aggiungere 1 ml di perossido di idrogeno per l'acido solforico per rendere la soluzione piranha ^14. Si prega di prendere tutte le precauzioni.
4. Lasciare il chip nanoporo in ammollo in una soluzione piranha per 10 minuti.
5. Rimuovere la soluzione piranha dal bicchiere con una pipetta di vetro. Mettere in un recipiente corretta conservazione.
6. Fill il bicchiere con la de-gasati, acqua deionizzata usando una pipetta di vetro pulito. Bicchiere vuoto di acqua e ripetere almeno 5 volte.
7. Rimuovere il chip nanoporo con una pinzetta pulita e asciutta dalla luce di aspirazione
8. Immediatamente, sigillare il chip nanoporo nella camera (Fig. 2a, 2b). Il chip può essere fissato nella camera da O-ring o sigillante siliconico.
9. Riempire la camera con soluzione di KCl
10. Collegare l'Ag / AgCl elettrodi alla camera (Fig. 2b). Elettrodi può essere effettuato mediante ammollo filo d'argento in candeggina durante la notte.
11. Applicare un potenziale transmembrana attraverso gli elettrodi e monitorare la risposta corrente utilizzando un Axon 200B patch-clamp amplificatore in voltage-clamp mode.
12. Costruire un I / V (corrente-tensione) curva da misurazioni. L'I / V curva deve essere altamente lineare quando si usa 1 M KCl (Fig. 3). Conduttanza del nanoporo deve corrispondere al suo diametro. Se il nanoporo non visualizzalineare I / V curva, la conduttanza è troppo bassa, o la corrente aperta del nanoporo non è stabile (Fig. 4a), significa che il nanoporo non è adeguatamente bagnato e lavaggio piranha deve essere ripetuto.

3. Monitoraggio delle proteine

1. E 'di fondamentale importanza per effettuare esperimenti di controllo con un unico nanoporo membrana o array parallelo di nanopori (vedi sotto) per monitorare la corrente con le condizioni di buffer manca il campione. Vi consigliamo i seguenti due passi: (i) l'utilizzo di un alto livello di purezza del buffer (purezza> 99,9%; cromatografia-grade livello), e (ii) l'uso di un buffer la cui interazione con il nanoporo a stato solido non produrre monocanale eventi. Inoltre, si consiglia di ottenere un elevato grado di purezza del campione di proteine ​​utilizzando le normali procedure di chimica delle proteine. La purezza del campione di proteine ​​deve essere controllato da sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) e analisi di gel ad alta risoluzione maspettrometria di ss ^15.
2. Aggiungere un campione purificato della proteina da studiare a terra nel bagno della camera. Lasciare il tempo per il campione di diffondersi in tutto il bagno. Concentrazioni tipiche di proteine ​​che può essere misurata in decine di nM alla gamma mM ^7,15-21.
3. Applicare un potenziale bias di transmembrana tensione con polarità opposta a quella della carica totale della proteina oggetto di studio. Per esempio, BSA ha un efficace carica netta negativa a pH 7,4, e quindi una tensione di polarizzazione positiva deve essere applicato. La tensione applicata crea gradiente di potenziale all'interno del nanoporo interni e le proteine ​​di cariche opposte sarà guidata da forze opposte. Solo polarità della tensione che guidano le proteine ​​nel nanoporo creerà segnali misurabili.
4. Un potenziale applicato di grandezza di 200 mV dovrebbe essere grande abbastanza per osservare analiti più proteine. Eventi apparirà come transitori attuali deviazioni dalla linea di fondo (Fig. 4b).Se nessun segnale è osservato, aumentare la concentrazione della proteina nella camera. Tensioni superiori migliorare il rapporto segnale-rumore. Nanopori nitruro in grado di sopportare parecchi volt.
5. Adsorptions proteina apparirà come longeva cambiamenti nella linea di base corrente del nanoporo (Fig. 4c).

4. Possibilità di funzionalizzazione dei nanopori

Esistono diversi metodi per l'applicazione di gruppi funzionali di nitruro di silicio ^22,23. La maggior parte dei film di nitruro di un sottile strato di ossido sulla parte esterna e l'esposizione all'ozono può creare un ulteriore strato di ossido, se necessario. Organosilani possono essere usati diversi e di auto-assemblati sui livelli del genere. Di particolare interesse è aminosilane, che auto-assembla e può essere ulteriormente modificato (per esempio acido carbossilico e aldeidi), consentendo l'ispezione di una vasta gamma di superfici organiche. Dopo un nanoporo è stato lavato con piranha e fissato nel Chamber, amine possono essere aggiunti direttamente al bagno camera con un elettrolita di supporto di 0,5 M TBACl (tetrabutilammonio) e MeOH anidro (metanolo) usato come solvente. Formazione di monostrato può essere monitorato attraverso l'applicazione di un bias tensione 400 mV e la misura della caduta di corrente ^23.

5. Determinazione del primo ordine apparente velocità di reazione costante e la Langmuir adsorbimento costante utilizzo di matrici nanoporo parallelo

5.1 Il primo ordine apparente costanti di velocità di reazione per l'assorbimento e desorbimento

Sottolineiamo che l'aspetto positivo di questa metodologia è la sua capacità di osservare adsorptions individuali a livello di singola molecola. La singola molecola misure di proteine ​​adsorbimento su una superficie inorganica può essere scalata fino impiegando matrici parallele a stato solido nanopori. L'array parallelo di nanopori è necessaria a causa della necessità di pori molti test per ottenere statistiche affidabilis. A tal fine, l'uso di un array nanoporo permetterebbe il monitoraggio delle adsorptions individuali così come la misurazione di più eventi per ulteriori analisi. Un array di nanopori in nitruro di silicio può essere costituita dal protocollo sopra semplicemente fori multipli nel campione. Ogni nanoporo dovrebbe essere di dimensioni simili. Array di nanopori di 6x6 o 7x7 dovrebbe essere adeguato. Dopo l'aggiunta di analita proteico nella camera, la corrente decade in modo esponenziale con la seguente espressione:

I _t = I _∞ - (I _∞ - I ₀₎ exp (-k 't)

Ecco, io _t, indica la corrente in un tempo t sperimentale. I ₀ è il passaggio originale corrente attraverso l'array nanoporo. I _∞ indica la corrente a livello di saturazione (cioè infinito). K 'è l'apparente primo ordine velocità di reazione costante, che può essere determinato da the in forma della curva sperimentale. Una maggiore k 'può essere interpretato come un tasso più veloce assorbimento. Il rapporto I _∞ / I _0, detta anche la saturazione normalizzato corrente, è un numero adimensionale compreso tra 0 e 1. Questo parametro è una misura della occupazione da parte degli analiti proteine ​​adsorbite. Pertanto, ogni condizione diversa sperimentale dovrebbe essere associata a due parametri di output specifici I _∞ / I ₀ e k '.

Va notato che l'apparente primo ordine costanti di velocità di assorbimento e le correnti normalizzate sono influenzati dal tempo effettivo di permanenza delle proteine ​​all'interno del nanopori. Questa volta dipende dalla concentrazione di analiti di proteine ​​alla rinfusa fase acquosa ^24. Pertanto, la correzione aggiuntiva di questi numeri deve essere attuato in base al tempo effettivo di permanenza delle proteine ​​all'interno del nanoporo interni. Si consiglia la misurazione della frequenza dei fast (traslocazione) manifestazioni e moltiplicandolo per il tempo di permanenza media di tali eventi. Questo darà il tempo medio trascorso all'interno delle proteine ​​all'interno nanoporo per unità di tempo.

Il tasso costante di desorbimento può essere determinata utilizzando una matrice parallelo di nanopori pure. Non appena il livello corrente raggiunge la saturazione (I _∞), la tensione deve essere invertito, quindi non più proteine ​​sono intrappolati nel nanopori. Desorbimento delle singole proteine ​​saranno accompagnati da alterazione della corrente ha registrato una maggiore valori. La costante di velocità sarà poi estratto dalle aumento del livello attuale.

5.2 La costante di adsorbimento Langmuir

L'assorbimento di analiti proteici sulle superfici inorganiche del nanopori dipende dalla concentrazione di proteine ​​in fase acquosa. Questo fenomeno è già stato osservato nel singola molecola livello ^13. Se θ rappresentano s la corrente di saturazione normalizzato _(∞ I / I _0), poi una tipica equazione isoterma di Langmuir è data dalla seguente espressione:

dove C è la concentrazione di proteine ​​in fase acquosa. α è la costante di adsorbimento Langmuir. Questo aumenta costante con un aumento della energia di legame di adsorbimento e con una diminuzione della temperatura. La raccolta dei punti dati θ darà lavoro a misure con array paralleli effettuati in varie concentrazioni di proteine ​​in fase acquosa. I dati dovrebbero essere analizzati in combinazione con altre tecniche per verificare la grandezza della costante di Langmuir dotato di adsorbimento. Inoltre, le simulazioni molecolari full-atomistica dinamica ^25,26 potrebbe anche essere utilizzato per aiutare le interpretazioni dei dati sperimentali ottenuti.

titolo "> 6. Risultati Rappresentante

I risultati tipici per solid-state nanopori sarà la seguente. La corrente a poro aperto dovrebbe essere altamente stabile, come si vede nella fig. 4 bis. I / V caratteristiche del nanoporo dovrebbe essere altamente lineare in 1 M KCl, 10 potassio fosfato, pH 7,4, come si vede nella fig. 2. La pendenza di una misura lineare di I / V curva fornirà la conduttanza unitaria del nanoporo. La conduttanza è una relazione diretta al diametro nanoporo e deve corrispondere l'equazione: , Dove G è la conduttanza del nanoporo, d è il diametro, l è la sua lunghezza, e σ è la conducibilità della soluzione nella camera ^14. Questo valore deve corrispondere entro il 30%. Se è troppo piccolo, il poro non è probabilmente bagnata. Con l'aggiunta di proteine, eventi rapidi dovrebbe derivarne, come si vede nella fig. 4b. Protein adsorbimento è un longevo caduta di corrente come mostrato in fig. 4c. Alcune proteine ​​sono molto labili e subiscono trasformazioni strutturali all'interno del poro interno. In questo caso, il longevo caduta di tensione sarà accompagnato da rapide fluttuazioni.

Figura 1. Nanoporo a stato solido realizzati con un F20 Tecnai S / TEM. Il poro è stato perforato in modalità STEM ad un diametro di 20 nm. L'immagine è stata scattata in campo chiaro modo TEM. Nitruro è stata di 30 nm di spessore.

Figura 2. Camera utilizzati per ospitare un singolo stato solido nanoporo in resistivo impulsi misurazioni. A) Camera e un chip di silicio con free-standing finestra di nitruro (griglia TEM). Il nanoporo è esercitato nel nitruro prima di caricarla. Rosso o-ring vengono utilizzati per formare un buon seal circa il chip, che separa due bagni di soluzione ionica. B) Schema della camera che mostra il posizionamento dei bagni di soluzione ed elettrodi rispetto alla nanoporo.

Figura 3. Tipiche di I / V per tracce a stato solido nanopori di diverso diametro. Tracce monocanale elettrici sono stati presi in 1 M KCl, 20 mM Tris, pH 8,5. Nanopori sono stati perforati nitruro di silicio a 30 nm di spessore. Nitruro di spessore nota influenzerà la conduttanza unitaria del nanoporo.

Figura 4. Misurata monocanale tracce di corrente e il rilevamento di proteine ​​di adsorbimento. A) Un solo canale traccia elettrica che mostra la corrente aperta di un nanoporo 10 nm di diametro. B) deviazioni correnti rappresentano il partizionamento di albumina bovina (BSA) nella interior del nanoporo. C) Adsorbimento di BSA sulla superficie del nitruro. Tutte le tracce sono della stessa nanoporo in 1 M KCl, 10 mM di potassio fosfato, pH 7,4. Il potenziale transmembrana è stata applicata 40 mV e BSA è stato aggiunto al bagno camera di messa a terra ad una concentrazione di 120 nM.

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Discussione

Adsorbimento spontanea di proteine ​​su superfici a stato solido ^27-29 è di fondamentale importanza in numerosi settori, quali le applicazioni biochip e la progettazione di una nuova classe di biomateriali funzionali ibride. Studi precedenti hanno dimostrato che le proteine ​​adsorbite a stato solido superfici non mostrano la mobilità laterale o tassi di desorbimento significative, e quindi delle proteine ​​è generalmente considerato un processo irreversibile e non specifico ^30-32. D...

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Materiali

Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tecnai F20 S / TEM	FEI		S / TEM richiede una tensione di accelerazione ≥ fonte 200kV e campo di emissione.
20 nm di spessore della membrana finestra di nitruro di silicio per TEM	SPI	4163SN-BA
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplificatore	Molecular Devices
Axon Digidata 1440A	Molecular Devices
pCLAMP 10 software	Molecular Devices		Elettrofisiologia di acquisizione dati e analisi del software
Acido solforico	Fisher scientifico	A300
perossido di idrogeno	Fisher Scientific	H325
silicone O-ring	McMaster-Carr	003 S70	In alternativa utilizzare PDMS
Filo d'argento	Sigma-Aldrich	348759	Per elettrodi
SPC Technology, D-sub contatto, pin	Newark	9K4978	Per elettrodi
cloruro di potassio	Sigma	P9541
potassio fosfato bibasico	Sigma	P2222
potassio fosfato monobasico	Sigma	P5379
PDMS	Dow Corning		Sylgar 184 Eelastomero set. Per fare da camera.
Kwik-Cast Sigillante	Mondo Strumenti di precisione	KWIK-CAST	Veloce sigillante siliconico recitazione
piastra calda	Fisher Scientific
Gabbia di Faraday