Amida de hidrógeno / deuterio intercambio y MALDI-TOF análisis de espectrometría de masas de Pak2 activación

Resumen

MALDI-TOF espectrometría de masas fue utilizada con éxito para controlar la amida hidrógeno / deuterio cambio en la activación de proteína quinasa Pak2.

Resumen

Amida de hidrógeno / deuterio intercambio (H / D intercambio) acoplada a espectrometría de masas ha sido ampliamente utilizado para analizar la interfaz de las interacciones proteína-proteína, los cambios conformacionales de proteínas, dinámica de las proteínas y las interacciones ligando-proteína. H / D intercambio de las posiciones de columna vertebral amida se ha utilizado para medir las tasas de deuteración de las micro-regiones de una proteína por espectrometría de masas ^1,2,3. La resolución de este método depende de la digestión con pepsina de la proteína de interés deuterado en péptidos que normalmente rango 3-20 residuos. Aunque la resolución de H / D intercambio medido por espectrometría de masa es menor que la resolución solo residuo medido por el heteronuclear único coherencia cuántica (HSQC) el método de RMN, espectrometría de masas de la medición de H / D intercambio no estará limitado por el tamaño de la proteínas ^4. H / D intercambio se lleva a cabo en una solución acuosa que mantiene la conformación de proteínas. Ofrecemos un método que utilriza el MALDI-TOF para la detección de ^dos, en lugar de un sistema HPLC / ESI (ionización electrospray)-MS ^5,6. El MALDI-TOF ofrece datos precisos sobre la intensidad de la masa de los péptidos de la proteína digerida, en este caso quinasa Pak2 proteína (también llamada γ-Pak). La proteólisis de Pak 2 se lleva a cabo en una digestión de la pepsina en línea. Este método alternativo, cuando el usuario no tiene acceso a una columna de HPLC y la pepsina conectado a la espectrometría de masas, o cuando la columna de la pepsina en HPLC no se traduce en un mapa de una digestión óptima, por ejemplo, la muy unidas por puentes disulfuro secreta fosfolipasa A _{2 (sPLA2).} Utilizando este método, hemos logrado controlar los cambios en el nivel deuteración durante la activación de la caspasa 3 Pak2 por división y la autofosforilación ^7,8,9.

Protocolo

1. Pak2 activación

1. Añada la cantidad de pre-prueba de la caspasa 3 a 20 l de 12 mg / ml Pak2 en un buffer y (50 mM de TDT mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, y 2 a pH 7,5) se incuba a 34 ° C durante 30 minutos totalmente a romper, y Pak2 activar.
2. Analizar los productos de degradación por SDS-PAGE (10%) y la tinción Coommassie azul.
3. Agregue el Pak2 se pegaba a la activación de amortiguación B (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 15 mM MgCl _2, 10 mM ATP) a un pH de 7,5, en 20 l para una concentración final de 10 mg / ml Pak2, e incubar a 34 ° C durante 30 minutos para activar plenamente Pak2 por autofosforilación en 8 sitios.
4. Confirmar la ruptura completa de Pak2 por la migración de la p34 y p27 fragmentos según lo determinado por SDS-PAGE ^10. Un adecuado control de las condiciones de la autofosforilación se hace a través de autorradiografía en un experimento separado con ^(32P) ATP o la espectrometría de masas para detectar fosfopéptidos.

2. Identificaciónde la pepsina-digeridos Pak2 Fragmentos

1. Añadir 1 ml de 0,1% de ácido Trifluroacetic (TFA) a un pH de 2,5 a lavar las cuentas de agarosa dos veces antes de su uso. A continuación, centrifugar las muestras de 15 segundos a 2.000 xg para extraer las bolas.
2. Añadir Pak2 (20 mg en 2 l de 150 mM NaCl, 50 mM de TDT mM Tris-HCl y 2 a pH 7,5) a 100 l de TFA al 0,1%, e incubar la muestra durante 5 minutos con 30 l de pepsina conjugado bolas de agarosa .
3. Equilibrar una columna de HPLC en fase reversa C18 con un sistema solvente principal de 0,1% TFA a pH 2,5. El resumen de la pepsina (50 l) se eluye con un lineal de 100 min gradiente de 0 a 80% de acetonitrilo que contiene 0,1% de TFA en un caudal de 0,2 ml / min. Fracciones se recogen cada 2 minutos.
4. Seco de las fracciones HPLC con un Speed-Vac (3 h) y volver a suspender las muestras en una solución de acetonitrilo (5 l) y 0,1% de TFA (5 l) a pH 2,5.
5. Inicialmente, cada fracción se analiza para detectar péptidos utilizando el MALDI-TOF PerSeptive Biosystems Voyager STR DE (PE Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.).
6. El 16 fracciones que contiene péptidos son sometidos a espectrometría de masas en tándem con un espectrómetro de masas Q-TOF y QSTAR XL oMALDI MS / MS para identificar los fragmentos.
7. La secuencia de cada péptido se verifica por los iones de producto generado por la espectrometría de masas en tándem con el teórico m / z de coeficientes basados ​​en la secuencia primaria de Pak2 utilizar el sitio de proteínas Prospector ( http://prospector.ucsf.edu/ ) ^11.

3. Medición de la Amida H / D intercambio

1. Mantenga todas las soluciones y reactivos necesarios para H / D intercambio a 25 ° C en un baño de agua. ATP se disuelve en agua y el pH se ajustó a 7,0 antes de su uso. Los otros 4 mM de ATP en el buffer D ₂ O es evitar ATP disociada de Pak2 después de la dilución.
2. Iniciar H / D intercambio mediante la adición de 18 l de tampón D ₂ O (50 mM MOPS pH 6.98, 125 mM NaCl) a 2 l (20 mg) De Pak2 en un tampón que contiene 150 mM NaCl, 50 mM de TDT mM Tris-HCl (pH 7.5) y 2, resultando en un nivel Pak2 de 10 mg / ml y un pH de 7,0 a 0 ° C.
3. Incubar las muestras por triplicado en el intercambio H / D de 0, 0,5, 1, 3, 5 y 10 minutos, o 24 h.
4. Apagar el proceso de H / D intercambio mediante la adición de 180 l de helado de TFA 0,1% a un pH de 2,2, lo que eleva el pH a 2,5 en un volumen final de 200 microlitros. Para las muestras que contienen ATP, 180 l de TFA helada 0,11% a un pH de 2,2 se utiliza para mantener el pH a 2,5 en la condición de temple.
5. Añadir un volumen (100 l) de cada muestra apagado a 30 l de la pepsina activa conjugado bolas de agarosa. La digestión de la pepsina se le permite continuar en el hielo durante cinco minutos y las muestras se agitaron cada 30 segundos.
6. Terminar la digestión por centrifugación de la muestra durante 15 segundos a 5000 xg a 4 º C para eliminar la pepsina.
7. Rápidamente congelar las muestras en N2 _líquido y se almacena a -80 ° C durante no más de 2días antes de MALDI-TOF análisis.
8. La matriz de MALDI es de 5 mg / ml de α-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA) disuelto en una solución (1:1:1) de acetonitrilo, etanol y 0,1% de TFA a pH 2,5 y se mantiene a 0 º C.
9. Parcialmente descongelar cada muestra de forma rápida y mezclar 1 l de cada muestra con una l de la matriz y el lugar en un 4 º C MALDI placa objetivo.
10. Aplicar un vacío moderado a secar la placa en los puntos 30 segundos antes de MALDI-TOF análisis. El tiempo entre la descongelación de la muestra y la recuperación de espectro es de unos 3 min.
11. Adquirir MALDI-TOF espectros de masas con un PerSeptive STR Biosystems Voyager DE. La adquisición de datos a una velocidad de muestreo de 2 GHz a 100.000 canales de datos, con una tensión de 20.000 V la aceleración, y una tensión de red 65% mediante la extracción de retraso con un retraso de pulso de 180 ns. Un centenar de las exploraciones se hacen un promedio de 2 min. El instrumento MALDI-TOF no se limita a cualquier marca o cualquier otro software en particular.
12. Use el Explorador de datos del programa informático de 4,0 a calculse comió la deuteración de cada fragmento.
13. Calcule el cambio de nuevo sobre la base de la relación entre el número real de deuterón incorporado a las 24 horas de H / D intercambio dividido por todos los sitios posibles canjeables, que son las amidas de columna vertebral, excepto la amida N-terminal (Figura 1).

4. Los resultados representativos:

La escisión de la caspasa y la autofosforilación son verificados por SDS-PAGE tinción Commassie. Pak2 inactiva es una sola banda de 58 kDa. División de la caspasa Pak2 es completa, y produce dos fragmentos, p27 y p34 que migran por separado. La migración de p27 y p34 autophosphorylated muestra una superposición en el gel debido a la migración retardada de la completamente fosforilados p27 fragmento (Figura 2).

H / D intercambio experimentos se llevan a cabo varias veces entre 0 y 10 min (Figura 3). A modo de ejemplo, el curso temporal de la incorporación de deuterio en el m / zpEAK 1697.85 de Pak2 inactiva está compuesta de múltiples picos isotópicos como lo muestra el desplazamiento de la masa sobre el paso del tiempo.

Figura 1. La ecuación para el cálculo de la deuteración.

Figura 2. Autofosforilación y la escisión de la caspasa Pak2. Caspasa-escindida Pak2 (carril izquierdo), Pak2 intacta inactivo (carril central) y la caspasa-escindida autophosphorylated Pak2 (carril derecho) fueron analizados por SDS-PAGE y tinción Coommassie azul. Adaptado de Hsu, YH et al ^2.

Figura 3. Espectro de masas de un curso de tiempo de la incorporación de deuterio, para Pak2 inactivo. Pak2 inactiva fue sometido a H / D exchaESN de 00 a 10 min y se analizaron por MALDI-TOF. Un ejemplo de la amplia distribución isotópica de MALDI-TOF de pico m / z 1697.85 durante el curso temporal de H / D intercambio se muestra. La línea roja punteada indica el promedio de la envolvente de la masa y el desplazamiento de la masa sobre la muestra deuteración de un péptido.

Discusión

Identificación de los fragmentos digeridos con pepsina es un paso crítico de la experiencia de H / D intercambio. Una incorrecta identificación de los péptidos puede llevar a una conclusión equivocada. Pak2 pepsina digerida se eluye a través de una columna HPLC en fase reversa C18 para obtener un fondo limpio. En nuestros experimentos, un total de 40 fracciones fueron recogidos y sometidos a MALDI-TOF. Múltiples péptidos podrían ser identificados en cada una de las fracciones. Los péptidos fueron sometidos a espectrometría de masas tándem (Q-TOF MS / MS y oMALDI MS / MS) para identificar sus secuencias. Los espectros MS / MS de un péptido debe tener al menos tres iones producto para confirmar la identificación de los péptidos.

El Explorador de Datos programa de ordenador 4.0 (Applied Biosystems) realiza la corrección de línea de base inicial y filtración de ruido. Cada espectro deberá ser calibrado a partir de dos picos en secuencia. Calibramos nuestro espectro de la masa teórica de la undeuterated m / z que son 923,45 y 1.697,84. Tél precisión la masa después de la calibración puede llegar a 10 ppm. Al deuteración, el mono-isótopo puede cambiar a una masa mayor. Aumenta unitaria paso a estas relaciones m / z dado a las masas asociadas a una mayor deuteración. El pico de intensidad de la envoltura de masa no afectará el nivel de deuteración. Sin embargo, las intensidades de los picos isotópicos en un sobre de masas en particular son esenciales para el cálculo de la masa media. El primer paso para el cálculo del deuterón incorporado es restar la masa de péptidos de la muestra no deuterado de la muestra deuterado. Hay otros tres factores, el D ₂ O de dilución, los deuterones residual en las cadenas laterales y el intercambio de nuevo, tendrá que ser consideradas en el cálculo (Figura 1). La dilución D ₂ O es el factor de dilución de D ₂ O después de mezclar la muestra y D ₂ O de amortiguación para iniciar el intercambio H / D. El deuterón residual (4,5%) en las cadenas laterales de la pepsina de digerirpéptidos ed tiene que restarse. La parte posterior de intercambio es la inevitable pérdida de deuteración en todos los péptidos deuterado y la pepsina digerida en el proceso de medición de la masa.

El péptido más accesible disolvente (m / z = 1105,60) después de 24 horas de H / D intercambio representa una región deuteración completo. El número deuterón incorporados para cada uno de los péptidos es la diferencia entre el centro de gravedad de los péptidos péptica deuterados y no deuterados-Pak2. Los más deuterado péptido m / z 1105 fue seleccionado para representar deuteración completa cuando Pak2 fue a las 24 horas de H / D intercambio. La Ecuación de Canje Volver fue calculado por el número real de deuterio incorporado a las 24 horas de H / D intercambio dividido por todos los sitios posibles canjeables en péptido m / z 1105.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
D 2 O	Aldrich	7789-20-0
α-ciano-4-hidroxicinámico	Sigma	28166-41-8
MALDI-TOF	PE Biosystems	Voyager DE STR
Q-TOF espectrómetro de masas	Q-TOF Ultima-Global
QSTAR XL oMALDI MS / MS	Applied Biosystems
Data Explorer 4.0 programa de ordenador	Applied Biosystems