Amida de hidrogênio / deutério Exchange & MALDI-TOF Análise Espectrometria de Massa de PAK2 Ativação

Resumo

MALDI-TOF espectrometria de massa foi utilizado com sucesso para monitorar a troca hidrogênio / deutério amida em proteína quinase PAK2 ativação.

Resumo

Troca hidrogênio / deutério amida (H / D de câmbio) acoplado com espectrometria de massa tem sido amplamente utilizado para analisar a interface de interações proteína-proteína, mudanças conformacionais de proteínas, dinâmica de proteína e proteína-ligante interações. H / D de câmbio sobre as posições amida espinha dorsal tem sido utilizada para medir as taxas de deuteração do micro-regiões em uma proteína por espectrometria de massa ^1,2,3. A resolução deste método depende da digestão da proteína pepsina deuterado de interesse em peptídeos que, normalmente, faixa 3-20 resíduos. Embora a resolução de H / D de troca medido por espectrometria de massa é menor do que a resolução resíduo única medida pelo único método Quantum Coherence heteronucleares (HSQC) da RMN, a medição de espectrometria de massa em H / D de câmbio não é limitada pelo tamanho da proteínas ^4. H / D de câmbio é realizada em uma solução aquosa que mantém a conformação da proteína. Nós fornecemos um método que utilizes o MALDI-TOF para a detecção de ^dois, em vez de um HPLC / ESI (ionização electrospray)-MS sistema ^5,6. A MALDI-TOF fornece dados precisos intensidade de massa para os peptídeos da proteína digerida, neste caso, a proteína quinase PAK2 (também chamado de γ-Pak). Proteólise de Pak 2 é realizado em uma digestão pela pepsina offline. Este método alternativo, quando o usuário não tem acesso a uma coluna de HPLC e pepsina conectado a espectrometria de massa, ou quando a coluna de pepsina em HPLC não resultar em um mapa melhor digestão, por exemplo, o bissulfeto-ligados fortemente secretado Fosfolipase A ₂ (SPLA _2). Utilizando este método, conseguimos monitoradas as mudanças no nível deuteração durante a ativação da caspase PAK2 por clivagem 3 e autofosforilação ^7,8,9.

Protocolo

1. PAK2 Ativação

1. Adicione a quantidade pré-testados apropriado de caspase 3-20 mL de 12 mg / ml em tampão PAK2 A e (50 mM DTT mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, e 2 em pH 7,5) incubar a 34 ° C por 30 min plenamente decompor e PAK2 ativar.
2. Analisar os produtos de dissociação por SDS-PAGE (10%) e coloração Coommassie azul.
3. Adicione o PAK2 clivada para a ativação de buffer B (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 15 mM MgCl _2, 10 mM ATP) em pH 7,5, em 20 l para uma concentração final de 10 mg / ml PAK2, e incubar a 34 ° C por 30 min para ativar completamente PAK2 por autofosforilação em 8 sites.
4. Confirmar clivagem cheio de PAK2 pela migração do p34 e p27 fragmentos como determinado por SDS-PAGE ^10. Verificação adequada das condições autofosforilação é feita através de autoradiografia em um experimento separado usando ⁽³² P) ATP ou espectrometria de massa para detectar fosfopeptídeos.

2. Identificaçãode pepsina-digerida PAK2 Fragments

1. Adicionar 1 ml de 0,1% de ácido Trifluroacetic (TFA) em pH 2,5 para lavar as contas agarose duas vezes antes de usar. Então, centrifugue as amostras por 15 segundos a 2.000 xg para remover as contas.
2. Adicionar PAK2 (20 mg em 2 mL de 150 mM NaCl, 50 mM DTT mM Tris-HCl e 2, pH 7,5) para 100 l de TFA 0,1%, e incubar a amostra por 5 min com 30 mL de contas pepsina-conjugado de agarose .
3. Equilibrar uma coluna de HPLC de fase reversa C18 com um sistema primário de solvente de TFA 0,1% em pH 2.5. O resumo da pepsina (50 ul) é eluída usando um gradiente de 100 min-linear de 0-80% de acetonitrila contendo TFA 0,1% a uma vazão de 0,2 ml / min. Frações são coletadas a cada 2 min.
4. Seca as frações de HPLC com uma velocidade-vac (3 h) e ressuspender as amostras em uma solução de acetonitrila (5 mL) e TFA 0,1% (5 mL), pH 2.5.
5. Inicialmente, cada fração é testado para peptídios usando o MALDI-TOF PerSeptive Biosystems Voyager STR DE (PE Biosystems, Foster City, CA, EUA).
6. As 16 frações contendo peptídeos são submetidos a espectrometria de massa em tandem utilizando um espectrômetro de massa Q-TOF e um QStar XL oMALDI MS / MS para identificar os fragmentos.
7. A seqüência de cada peptídeo é verificado pelos íons produto gerado pela espectrometria de massa em tandem com a teórica m / z relações com base na seqüência primária de PAK2 usando a Protein Prospector website ( http://prospector.ucsf.edu/ ) ^11.

3. Medição de amida H / D Câmbio

1. Mantenha todas as soluções e reagentes necessários para H / D de câmbio em 25 ° C em banho-maria. ATP é dissolvido em água eo pH é ajustado para 7,0 antes da utilização. O adicional de 4 mM ATP na ₂ D O tampão é para prevenir ATP dissociada PAK2 após a diluição.
2. Iniciar H / D de troca através da adição de 18 mL de tampão D ₂ O (50 mM pH 6,98 MOPS, 125 mM NaCl) a 2 mL (20 mg) De PAK2 em um tampão contendo 150 mM NaCl, 50 mM DTT mM Tris-HCl (pH 7,5) e 2, resultando em um nível PAK2 de 10 mg / ml e um pH de 7,0 a 0 ° C.
3. Incubar as amostras em triplicata na troca H / D de 0, 0,5, 1, 3, 5 e 10 min, ou 24 h.
4. Extinguir o H / D processo de troca, adicionando 180 mL de gelada TFA 0,1% em pH 2.2, que traz o pH para 2,5 em um volume final de 200 mL. Para as amostras contendo ATP, 180 mL de gelo frio TFA 0,11% em pH 2.2 é utilizado para manter o pH de 2,5 na condição saciada.
5. Adicionar uma alíquota (100 l) de cada amostra a 30 mL saciada de contas ativadas pepsina-conjugado de agarose. A digestão pepsina é permitido proceder em gelo por cinco minutos e as amostras são centrifugadas a cada 30 seg.
6. Terminar a digestão por centrifugação da amostra por 15 segundos a 5.000 xg a 4 ° C para remover a pepsina.
7. Rapidamente congelar as amostras em N ₂ líquido e armazenar a -80 ° C para não mais de 2dias antes da MALDI-TOF análise.
8. A matriz para MALDI é de 5 mg / ml de α-ciano-4-hidroxicinâmicos ácido (CHCA) dissolvido em uma solução (1:1:1) de etanol, acetonitrila e TFA 0,1% em pH 2,5 e mantidos a 0 ° C.
9. Parcialmente descongelar cada amostra rapidamente e misture 1 ml de cada amostra com 1 ml de matriz e local em um 4 ° C placa-alvo MALDI.
10. Aplicar um vácuo moderado ao prato para secar os pontos em 30 segundos antes de MALDI-TOF análise. O tempo entre o descongelamento da amostra e recuperação de espectro é de cerca de 3 min.
11. Adquirir MALDI-TOF espectros de massa com um Voyager Biosystems PerSeptive STR DE. Aquisição de dados em uma taxa de amostragem de 2 GHz a 100 mil canais de dados, com uma tensão de 20.000 V de aceleração, e uma tensão de rede usando 65% de extração atrasada com um atraso de pulso de 180 ns. Cem exames são em média de 2 min. O instrumento MALDI-TOF não se restringe a qualquer marca ou qualquer outro software específico.
12. Usar o Data Explorer programa de computador 4.0 para calculcomeu o deuteração de cada fragmento.
13. Calcular o câmbio de volta com base na razão entre o número deuteron real incorporado em 24 hr de H / D troca dividido por todos os possíveis locais de troca, que são a espinha dorsal amidas exceto a amida N-terminal (Figura 1).

4. Resultados representativos:

A clivagem caspase e autofosforilação são verificados por SDS-PAGE coloração Commassie. PAK2 inativos é uma banda única de 58 kDa. Clivagem da caspase PAK2 está completa, e produz dois fragmentos, p27 e p34 que migram separadamente. A migração de p27 e p34 autofosforilada mostra uma sobreposição no gel devido à migração retardada do p27 totalmente fosforilados fragmento (Figura 2).

Experimentos H / D de câmbio são realizadas várias vezes entre 0 e 10 min (Figura 3). Como exemplo, o tempo de incorporação de deutério na m / zpeak 1.697,85 de PAK2 inativo é composto de vários picos de isótopos, como mostrado pela mudança do envelope de massa ao longo do tempo.

Figura 1. Equação para o cálculo da deuteração.

Figura 2. Autofosforilação e clivagem caspase de PAK2. Caspase clivada PAK2 (faixa esquerda), PAK2 inativos intacta (meio lane) e caspase clivada PAK2 autofosforilada (pista direita) foram analisadas por SDS-PAGE e coloração Coommassie azul. Adaptado de Hsu, YH et al ^2.

Figura 3. Espectro de massa de um curso do tempo de incorporação de deutério para PAK2 inativo. PAK2 inativos foi submetido a H / D exchaESL para 00-10 min e analisados ​​por MALDI-TOF. Um exemplo da distribuição expandida isotópica de MALDI-TOF de pico m / z 1.697,85 durante o curso do tempo de H / D de câmbio é mostrado. A linha vermelha pontilhada indica a média do envelope de massa e da mudança do envelope de massa mostra o deuteração de um peptídeo.

Discussão

Identificação dos fragmentos Pepsin-digerida é uma etapa crítica da experiência de troca H / D. Identificação incorreta do peptídeo pode levar a uma conclusão errada. PAK2 pepsina-digerida é eluído através de uma coluna de fase reversa HPLC C18 para obter um fundo limpo. Em nossos experimentos, um total de 40 frações foram coletadas e submetidas a MALDI-TOF. Peptídeos múltiplos puderam ser identificados em cada uma das frações. Os peptídeos foram submetidos a espectrometria de massa (Q-TOF MS / MS e oMALDI MS / MS) para identificar suas seqüências. Os espectros MS / MS de um peptídeo deve ter pelo menos três íons produto para confirmar a identificação do peptídeo.

O Data Explorer programa de computador 4.0 (Applied Biosystems) realiza a correção inicial, e filtragem de ruído. Cada espectro deve ser calibrado com base em dois picos seqüenciado. Nós calibrar nosso espectro pela massa teórica do undeuterated m / z que são 923,45 e 1.697,84. TEle precisão massa após a calibração pode chegar a 10 ppm. Após deuteração, o mono-isótopos podem se deslocar para uma maior massa. Aumenta o passo unitário para estes índices m / z rendeu as massas melhorada associada deuteração. As intensidades de pico do envelope de massa não afetará o nível deuteração. No entanto, o pico de intensidade dos picos de isótopos em um envelope de massa específica são fundamentais para o cálculo da massa média. O primeiro passo do cálculo do deutério é incorporada subtraindo a massa de peptídeos da amostra não-deuterado a partir da amostra deuterado. Três outros fatores, a diluição D ₂ O, os dêuterons residual nas cadeias laterais eo intercâmbio de volta, terá de ser ainda considerados no cálculo (Figura 1). A D ₂ O diluição é o fator de diluição de D ₂ O após a mistura da amostra e D ₂ O tampão para iniciar a troca H / D. O deutério residual (4,5%) nas cadeias laterais da pepsina-digestpeptídeos ed precisa ser subtraído. A parte de trás de troca é a perda inevitável de deuteração em todos os peptídeos deuterado e pepsina-digerida no processo de medição de massa.

O peptídeo mais acessíveis solvente (m / z = 1.105,60) após 24 horas de H / D de câmbio representa uma região deuteração completo. O número deuteron incorporados para cada um dos peptídeos é a diferença entre o centróide do deuterado e não deuterado peptídeos péptica PAK2. O peptídeo mais altamente deuterado m / z 1105 foi selecionado para representar deuteração cheia quando PAK2 foi de 24 h de H / D de câmbio. A Relação de Troca Voltar foi calculado pelo número deuteron real incorporado em 24 hr de H / D troca dividido por todos os possíveis locais de troca de peptídeo m / z 1105.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comments (opcional)
D 2 O	Aldrich	7789-20-0
α-ciano-4-ácido hidroxicinâmicos	Sigma	28166-41-8
MALDI-TOF	PE Biosystems	Voyager STR DE
Q-TOF espectrômetro de massa	Q-TOF Ultima-Global
QStar XL oMALDI MS / MS	Applied Biosystems
Data Explorer programa de computador 4,0	Applied Biosystems