Pak2 활성화의 아미드 수소 / 중수소 교환 및 든 - TOF 질량 분광법 분석

요약

든 - TOF 질량 분석법을 성공적으로 단백질 키나제 Pak2 활성화에 아미드 수소 / 중수소 교환을 모니터 활용했다.

초록

질량 분석계와 결합 아미드 수소 / 중수소 교환 (H / D 교환)은 광범위하게 단백질 - 단백질 상호 작용, 단백질 conformational 변화, 단백질 역학 및 단백질 - 리간드 상호 작용의 인터페이스를 분석하는 데 사용되었습니다. 백본 아미드 위치에 H / D 교환 대량 분석법 ^1,2,3하여 단백질의 마이크로 영역의 deuteration 속도를 측정하는 이용되었습니다. 이 방법의 해상도는 일반적으로 30-20 잔류물에서 다양한 펩티드에 대한 관심의 진정제를 맞았 단백질의 펩신의 소화에 따라 달라집니다. 질량 분석법에 의해 측정 H / D 교환의 해상도 NMR, H / D 교환에서 질량 분석계 측정의 헤테로핵 단일 양자 결맞음 (HSQC) 방법으로 측정 단일 잔여물 해상도보다 낮은이지만,의 크기에 의해 제한되지 않습니다 단백질 ^4. H / D 교환은 단백질 형태를 유지 수용액에서 수행됩니다. 우리는 방법을 제공 UTIL대신 HPLC / ESI (전기 분무 이온화) - MS 시스템 ^5,6의 검출 ² 든 - TOF를 izes. 든 - TOF이 경우 단백질 키나제 Pak2 (또한 γ - 박라고도 함)에서, 소화 단백질의 펩티드에 대한 정확한 대량 강도 데이터를 제공합니다. 박 2 Proteolysis는 오프라인 펩신의 소화에서 수행됩니다. 사용자가 질량 분광법에 연결된 HPLC 및 펩신 컬럼에 액세스할 때 또는 HPLC에있는 펩신 칼럼은 크게 이황화 - 보세 분비 포스 포 라이 페이스 _2, 예를 들어, 최적의 소화지도 발생하지 않는가없는이 대체 방법, (sPLA _2). 이 방법을 활용, 우리는 성공적으로 caspase 3 절단 및 autophosphorylation ^{7, 8, 9에} 의해 Pak2의 활성화 동안 deuteration 수준의 변화를 감시.

프로토콜

1. Pak2 활성화

1. 버퍼에 12 밀리그램 / ML Pak2 20 μl에 caspase 3의 적절한 사전 테스트 금액을 추가 (산도 7.5 50 MM 트리스 - HCL, 150 MM NaCl, 2 MM의 DTT) 34시 품어 ° C를 30 분 완전히 다니엘과 활성화 Pak2 수 있습니다.
2. SDS - PAGE (10 %)과 Coommassie 푸른 얼룩에 의해 절단 제품을 분석합니다.
3. 20 μl 10 밀리그램 / ML Pak2의 최종 농도, pH를 7.5에서 (50 MM 트리스 - HCL, 150 MM NaCl, 15 MM MgCl _2, 10 MM ATP) 활성화 버퍼 B에 죽습 Pak2를 추가, 34에서 부화 ° C 30 분에 대해 전적으로 8 사이트에서 autophosphorylation로 Pak2를 활성화합니다.
4. 로 SDS - ¹⁰ 페이지에 의해 결정 p34과 p27 조각의 마이 그 레이션에 의해 Pak2의 전체 절단을 확인합니다. autophosphorylation 조건 적절한 검증 phosphopeptides를 감지할 수 ⁽³² P) ATP 또는 질량 분석계를 사용하여 별도의 실험에서 autoradiography를 통해 이루어집니다.

2. 신분증의 펩신 - 소화 Pak2 파편

1. 사용하기 전에 두 번 아가로 오스 비즈를 씻어 산도 2.5에서 0.1 % Trifluroacetic 산성 (TFA) 1 ML을 추가합니다. 그런 다음 비즈를 제거하는 2,000 XG에 15 초를위한 샘플을 원심.
2. 0.1 % TFA 100 μl에 Pak2 (150 MM NaCl 2 μl 20 μg, 산도 7.5 50 MM 트리스 - HCL 2 MM의 DTT)을 추가하고 펩신 - 복합 아가로 오스 비즈 30 μl로 5 분 샘플을 품어 .
3. 산도 2.5에서 0.1 %의 TFA의 기본 용매 시스템에 반대 위상 HPLC C18 컬럼을 평형. 0.2 ML / 분의 유량에서 0.1 % TFA를 포함하는 80 % acetonitrile - 펩신 소화 (50 μl)이 0 선형 100 분 그라데이션을 사용하여 eluted 있습니다. 분수는 매 2 분을 수집하고 있습니다.
4. (3 H) 속도 VAC와 HPLC의 분수를 건조하고 acetonitrile (5 μl)와 산도 2.5에서 0.1 % TFA (5 μl)의 솔루션에 샘플을 resuspend.
5. 처음에는 각 분획이 든 - TOF PerSeptive Biosystems 보이저 드 STR (PE 동성를 사용하여 펩티드를위한 검사입니다osystems, 포스터 시티, CA, 미국).
6. 펩티드를 포함하는 16 분수는 조각을 식별할 수있는 Q - TOF 질량 분석기와 QSTAR XL oMALDI MS / MS를 사용하여 탠덤 질량 분광법를 받게됩니다.
7. 각 펩타이드의 시퀀스 단백질 광부 웹사이트 (사용 Pak2의 기본 순서에 따라 이론적 M / Z 비율로 탠덤 질량 분광법에 의해 생성된 제품의 이온에 의해 확인 http://prospector.ucsf.edu/ ) ^11.

3. 아미드 H / D 교환의 측정

1. 물 목욕 25에서 H / D 교환에 필요한 모든 솔루션 및 시약 ° C를 잡아. ATP는 물속에 녹아이며, 산도는 사용하기 전에 7.0으로 조정됩니다. D ₂ O 버퍼에 추가 4mm짜리 ATP는 희석 후 Pak2에서 dissociated ATP를 방지하는 것입니다.
2. (20 μg 2 μl로 버퍼 D ₂ O (50 MM의 맙스의 산도 6.98 125 MM NaCl) 18 μl를 추가하여 H / D 교환을 개시) 150 MM를 포함하는 버퍼 Pak2의 NaCl, 0 50 MM 트리스 - HCL (산도 7.5) 및 2 MM의 10 MG / ML의 Pak2 수준 결과 DTT, 및 7.0의 산도 ° C.
3. 0, 0.5, 1, 3, 5, 10 분, 또는 24 H.위한 H / D 교환 세중의에서 샘플을 품어
4. 200 μl의 최종 볼륨에서 2.5 산도을 제공 산도 2.2에서 얼음처럼 차가운 0.1 % TFA 180 μl을 추가하여 H / D 교환 과정을 끄다. ATP, 산도 2.2에서 얼음처럼 차가운 0.11 %의 TFA 180 μl를 포함하는 샘플 침묵 상태에서 2.5에서 산도를 유지하는 데 사용됩니다.
5. 활성화된 펩신 - 복합 아가로 오스 비즈 30 μl 각 침묵 샘플의 나누어지는 (100 μl)를 추가합니다. 펩신의 소화 다섯 분 얼음 진행하는 허용되고 샘플은 매 30 초 vortexed 있습니다.
6. 4 5000 XG에 15 초를위한 시료의 원심 분리하여 소화를 종료할 ° C는 펩신을 제거합니다.
7. 신속하게 더 이상 둘 이상을 -80 ° C에서 액체 N _2와 저장소에 샘플을 동결든 - TOF 분석하기 전에 일.
8. 든에 대한 매트릭스는 5 밀리그램 / ML α - cyano - 4 - hydroxycinnamic acetonitrile, 에탄올과 pH를 2.5에서 0.1 %의 TFA의 솔루션 (1시 1분 1초)에 용해와 0 ° C.에서 개최되는 산 (CHCA)입니다
9. 부분적으로 신속하게 각각의 샘플을 해동하고 4 ° C 든 대상 접시에 매트릭스와 현장 1 μl 각 샘플 1 μl를 섞는다.
10. 이전 든 - TOF 분석 30 초에있는 명소를 건조 판에 중간 진공을 적용합니다. 샘플 및 스펙트럼 검색의 해동 사이의 시간은 3 분 정도입니다.
11. PerSeptive Biosystems 보이저 드 STR과 함께 든 - TOF 질량 스펙트럼을 취득. 20000 - V 가속 전압 및 180 NS 펄스 지연과 지연 추출을 사용하여 65 % 그리드 전압, 100,000 데이터 채널에서 2 GHz의 샘플링 속도에서 데이터를 수집. 백 검사는 2 분 안에 평균입니다. 든 - TOF 장비는 모든 브랜드 또는 특정 소프트웨어에 한정되지 않습니다.
12. calcul에 데이터 Explorer 4.0을 컴퓨터 프로그램을 사용하여각 조각의 deuteration을 먹었어요.
13. N - 터미널 아미드 (그림 1)를 제외하고 백본 아미드있는 모든 가능한 교환 사이트 나눈 H / D 교환의 24 시간에서 실제 통합 deuteron 번호의 비율에 따라 다시 교환을 계산합니다.

4. 대표 결과 :

caspase 절단 및 autophosphorylation은 SDS - PAGE Commassie의 얼룩에 의해 확인됩니다. 비활성 Pak2 58 kDa의 단일 밴드입니다. Pak2의 Caspase 절단이 완료되며, 별도로 마이 그 레이션이 조각, p27과 p34을 생산하고 있습니다. p27과 p34 autophosphorylated 보여주는 완전히 phosphorylated p27 조각 (그림 2)의 지진아 마이 그 레이션에 의한 겔에 중복의 마이 그 레이션.

H / D 교환 실험은 0과 10 분, (그림 3) 사이를 여러 번 수행하고 있습니다. 예를 들어, M / zp에 중수소 설립의 시간 코스비활성 Pak2의 eak 1697.85는 같은 시간이 지남에 따라 대량 봉투의 변화에​​ 의해 나타난 여러 isotopic 봉우리로 구성되어 있습니다.

그림 1. deuteration의 계산을위한 수식.

그림 2. Autophosphorylation과 Pak2의 caspase 절단. Caspase - 죽습 Pak2 (왼쪽 차선), 손상 비활성 Pak2 (중앙 차선)와 caspase - 죽습 autophosphorylated Pak2 (오른쪽 차선)는 SDS - PAGE와 Coommassie 푸른 얼룩에 의해 분석되었다. 수의, YH 외 ² 적응.

그림 3. 비활성 Pak2에 대한 중수소 설립의 시간 코스의 질량 스펙트럼. 비활성 Pak2는 H / D excha를 받게되었다00-10 분 nge 및 든 - TOF로 분석했다. H / D 교환의 시간 코스 중에 최고 M / Z 1697.85의 든 - TOF의 확장 isotopic 배포판의 예제는 표시됩니다. 빨간색 점선은 대량 봉투의 평균을 나타냅니다하고 대량 봉투의 변화는 펩티드의 deuteration를 보여줍니다.

토론

펩신 - 소화 파편의 확인은 H / D 교환 실험의 중요한 단계입니다. 펩타이드의 잘못된 인식은 잘못된 결론으로​​ 이어질 수 있습니다. 펩신 - 소화 Pak2은 깨끗한 배경을 얻기 위해 반대 위상 HPLC C18 컬럼을 통해 eluted입니다. 우리의 실험에서 40 분수의 총 회수되었고 든 - TOF를 받게. 여러 개의 펩티드는 분수의 각 식별 수 있습니다. 펩티드들은 시퀀스를 식별하는 탠덤 질량 분광법 (Q - TOF MS / MS 및 oMALDI MS / MS)를 받게되었습니다. 펩타이드의 MS / MS 스펙트럼의 펩타이드의 신분을 확인하기 위해 적어도 세 제품 이온이 있어야합니다.

데이터 Explorer 4.0을 컴퓨터 프로그램 (응용 Biosystems)는 초기 기준 보정과 노이즈 여과를 수행합니다. 각 스펙트럼은 두 개의 봉우리 합성을 기반으로 보정해야합니다. 우리는 923.45과 1697.84있는 undeuterated M / Z의 이론적인 대량하여 스펙트럼을 보정. 티그는 교정 후 대량의 정확성은 10 PPM에 도달하실 수 있습니다. deuteration시 모노 동위 원소는 높은 미사로 이동됩니다. 이러한 M / Z 비율로 하나의 단계 증가 deuteration와 관련된 향상된 대중이 나왔고. 대량 봉투의 정상 농도는 deuteration 수준에 영향을 미치지 않습니다. 그러나, 특정 집단 봉투에 isotopic 봉우리의 정상 농도는 평균 질량 계산 중요하다. 통합 deuteron의 계산의 첫 번째 단계는 진정제를 맞았을 샘플에서 비 진정제를 맞았 샘플의 펩티드 질량을 빼서입니다. 세 가지 다른 요인, D ₂ O 희석, 사이드 체인과 다시 교환 잔류 deuterons은 더 (그림 1) 계산에 고려해야합니다. D ₂ O의 희석은 샘플을 믹싱 및 D ₂ O 버퍼 H / D 교환을 시작 후 D ₂ O의 희석 요소입니다. 펩신 - 다이제스트의 측면 체인의 잔류 deuteron (4.5 %)에드 펩티드는 빼서해야합니다. 다시 교환은 질량 측정 과정에있는 모든 진정제를 맞았 및 펩신 - 소화 펩티드의 deuteration의 피할 수없는 손실이다.

H / D 교환 24 시간 후 가장 용매 접근 펩타이드 (M / Z = 1105.60)은 전체 deuteration 지역을 나타냅니다. 펩티드의 각 통합 deuteron 번호는 진정제를 맞았와 비 진정제를 맞았 Pak2 소화제의 펩티드의 중심 사이의 차이입니다. 가장 높은 진정제를 맞았 펩타이드 M / Z 1105은 Pak2은 H / D 교환의 24 시간에 있었을 때 전체 deuteration을 대표로 선정되었다. 뒤로 교환 비율은 펩타이드 M / Z 1105에서 가능한 모든 교환 사이트로 나눈 H / D 교환의 24 시간에서 실제 통합 deuteron 번호로 계산되었다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글 (옵션)
D 2 O	올드 리치	7789-20-0
α - cyano - 4 - hydroxycinnamic 산	시그마	28166-41-8
든 - TOF	PE Biosystems	보이저 드 STR
Q - TOF 질량 분석계	Q - TOF 울티마 - 글로벌
QSTAR XL oMALDI MS / MS	응용 Biosystems
데이터 익스플로러 4.0 컴퓨터 프로그램	응용 Biosystems