Amid Wasserstoff / Deuterium-Austausch & MALDI-TOF-Massenspektrometrie Analyse der PAK2 Activation

Zusammenfassung

MALDI-TOF-Massenspektrometrie wurde erfolgreich genutzt, um die Amid-Wasserstoff / Deuterium-Austausch in Proteinkinase PAK2 Aktivierung überwachen.

Zusammenfassung

Amid Wasserstoff / Deuterium-Austausch (H / D-Austausch) gekoppelt mit der Massenspektrometrie wurde in großem Umfang verwendet werden, um die Schnittstelle von Protein-Protein-Interaktionen, Protein Konformationsänderungen, Protein-Dynamik und Protein-Ligand-Interaktionen zu analysieren. H / D-Austausch auf der Amid-Positionen wurde verwendet, um die Deuterierung Preise der Mikro-Regionen in einem Protein durch Massenspektrometrie ^1,2,3 messen. Die Auflösung dieser Methode hängt von Pepsinverdau der deuterierten Protein von Interesse in Peptide, die normalerweise im Bereich von 3 bis 20 Resten. Obwohl die Auflösung des H / D-Austausch durch Massenspektrometrie gemessen niedriger ist als die eines einzigen Rückstands Beschluss der Heteronucleare Single Quantum Coherence (HSQC)-Methode der NMR, Massenspektrometrie Messung in H / D-Austausch gemessen wird nicht durch die Größe der eingeschränkten protein ^4. H / D-Austausch erfolgt in einer wässrigen Lösung, die Proteinkonformation unterhält durchgeführt. Wir bieten Ihnen eine Methode, die utilIZES die MALDI-TOF zur Detektion ^2, statt einer HPLC / ESI (Elektrospray-Ionisation)-MS-System ^5,6. Die MALDI-TOF liefert genaue Masse Intensität Daten für die Peptide der verdauten Proteins, in diesem Fall Proteinkinase PAK2 (auch als γ-Pak). Proteolyse von Pak 2 ist in einer Offline-Pepsinverdau durchgeführt. Diese alternative Methode, wenn der Benutzer keinen Zugriff auf eine HPLC und Pepsin Säule verbunden mit der Massenspektrometrie, oder wenn das Pepsin Spalte HPLC nicht in eine optimale Verdauung Karte führen, zum Beispiel, die stark Disulfid-gebundenen abgesondert Phospholipase A ₂ (SPLA _2). Mit Hilfe dieser Methode haben wir erfolgreich überwacht Veränderungen in der Deuterierung Ebene während der Aktivierung des PAK2 durch Caspase-3 Spaltung und Autophosphorylierung ^7,8,9.

Protokoll

1. PAK2 Activation

1. Fügen Sie die entsprechenden vorgeprüft Höhe von Caspase 3 bis 20 ul von 12 mg / ml PAK2 in Puffer A (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl und 2 mM DTT bei pH 7,5) und Inkubieren bei 34 ° C für 30 min vollständig zu spalten und zu aktivieren PAK2.
2. Analysieren Sie die Spaltprodukte durch SDS-PAGE (10%) und Coommassie-Blau-Färbung.
3. Fügen Sie die gespalten PAK2 zur Aktivierung Puffer B (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 15 mM MgCl _2, 10 mM ATP) bei pH 7,5, in 20 ul bis zu einer Endkonzentration von 10 mg / ml PAK2, und inkubieren bei 34 ° C für 30 min vollständig zu aktivieren PAK2 durch Autophosphorylierung an 8 Standorten.
4. Bestätigen Sie volle Spaltung PAK2 durch den Zuzug von p34 und p27-Fragmente durch SDS-PAGE ¹⁰ bestimmt. Proper Überprüfung der Autophosphorylierung Bedingungen über Autoradiographie in einem separaten Experiment mit ⁽³² P) ATP oder Massenspektrometrie Phosphopeptide erkennen hergestellt.

2. Identifikationvon Pepsin verdaut PAK2 Fragments

1. 1 ml 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) bei pH 2,5, die Agaroseperlen zweimal vor waschen zu verwenden. Dann Zentrifuge die Proben für 15 sec bei 2.000 xg, um die Perlen zu entfernen.
2. Add PAK2 (20 ug in 2 ul 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl und 2 mM DTT bei pH 7,5) auf 100 ul 0,1% TFA, und inkubieren Sie die Probe für 5 min mit 30 ul Pepsin-konjugierten Agaroseperlen .
3. Äquilibrieren einer Reverse-Phase-HPLC-C18-Säule mit einem primären Lösungsmittel-System von 0,1% TFA bei pH 2,5. Das Pepsin verdaut (50 ul) wird eluiert mit einem linearen 100-min Steigung von 0 bis 80% Acetonitril mit 0,1% TFA bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml / min. Die Fraktionen werden alle 2 min gesammelt.
4. Trocknen Sie die HPLC-Fraktionen mit einem Speed-Vac (3 h) und Resuspendieren der Proben in eine Lösung von Acetonitril (5 ul) und 0,1% TFA (5 ul) bei pH 2,5.
5. Zunächst wird jede Fraktion für Peptide mit der MALDI-TOF PerSeptive Biosystems Voyager DE STR (PE Bi abgeschirmtosystems, Foster City, CA, USA).
6. Die 16 Fraktionen, die Peptide sind Tandem-Massenspektrometrie mit einem Q-TOF-Massenspektrometer und ein QStar XL oMALDI MS / MS, um die Fragmente zu identifizieren unterzogen.
7. Die Abfolge der einzelnen Peptid wird von der Produkt-Ionen durch die Tandem-Massenspektrometrie mit den theoretischen m / z-Verhältnisse auf dem Primär-Sequenz von PAK2 mit dem Protein Prospector Website (basierend generiert überprüft http://prospector.ucsf.edu/ ) ^11.

3. Messung von Amid H / D-Austausch

1. Halten Sie alle Lösungen und Reagenzien für die H / D-Austausch bei 25 ° C benötigt in einem Wasserbad. ATP wird in Wasser gelöst und der pH-Wert auf 7,0 vor der Anwendung angepasst. Die zusätzliche 4mm ATP in die D ₂ O-Puffer ist ATP dissoziiert verhindern PAK2 nach Verdünnung.
2. Initiate H / D-Austausch durch Zugabe von 18 ul der gepufferten D ₂ O (50 mM MOPS pH 6.98, 125 mM NaCl) bis 2 ul (20 ug) Von PAK2 in einem Puffer mit 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 2 mM DTT, was zu einer PAK2 von 10 mg / ml und einem pH-Wert von 7,0 bei 0 ° C.
3. Inkubieren Sie die Proben in dreifacher Ausfertigung in der H / D-Austausch für 0, 0,5, 1, 3, 5 und 10 min bzw. 24 h.
4. Quench der H / D-Austausch-Prozess durch Zugabe von 180 ul eiskaltem 0,1% TFA bei pH 2,2, die den pH-Wert bringt bis 2,5 in einem Gesamtvolumen von 200 ul. Für die Proben mit ATP, 180 ul eiskalter 0,11% TFA bei pH 2,2 wird verwendet, um den pH-Wert bei 2,5 im vergüteten Zustand zu halten.
5. Fügen Sie ein Aliquot (100 ul) jeder abgeschreckten Probe zu 30 ul aktiviert Pepsin-konjugierten Agaroseperlen. Die Pepsinverdau darf auf Eis für fünf Minuten gehen und die Proben werden alle 30 sec gevortext.
6. Beenden Sie die Verdauung durch Zentrifugation der Probe für 15 sec bei 5.000 xg bei 4 ° C zur Entfernung des Pepsins.
7. Schnell einfrieren der Proben in flüssigem N ₂ und bei -80 ° C für nicht mehr als 2Tage vor der MALDI-TOF-Analyse.
8. Die Matrix für MALDI beträgt 5 mg / ml α-cyano-4-Hydroxy-Säure (CHCA) in einer Lösung (1:1:1) Acetonitril, Ethanol und 0,1% TFA bei pH 2,5 aufgelöst und statt bei 0 ° C.
9. Teilweise Tauwetter jede Probe schnell und mischen Sie 1 ul jeder Probe mit 1 ul der Matrix und der Fleck auf 4 ° C MALDI Zieltafel.
10. Tragen Sie eine moderate Vakuum auf die Platte, um die Stellen in 30 sec vor der MALDI-TOF-Analyse trocken. Die Zeit zwischen dem Auftauen der Probe und Spektrum Abruf ist ca. 3 min.
11. Erwerben Sie MALDI-TOF-Massenspektren mit einem PerSeptive Biosystems Voyager DE STR. Erfassung von Daten in einem 2-GHz Abtastrate bei 100.000 Datenkanäle mit einem 20.000-V Beschleunigungsspannung und eine 65% Netzspannung mit verzögerter Extraktion mit einem 180-ns-Impuls zu verzögern. Einhundert-Scans sind in 2 min gemittelt. Die MALDI-TOF Instrument ist nicht auf eine Marke oder eine bestimmte Software beschränkt.
12. Verwenden Sie die Data Explorer 4.0 Computer-Programm zu calculaß die Deuterierung von jedem Fragment.
13. Berechnen Sie die Rückseite Austausch über das Verhältnis der tatsächlichen eingebaut Deuteron Zahl bei 24 Stunden von H / D-Austausch mit allen möglichen austauschbaren Stellen, die das Rückgrat Amiden mit Ausnahme des N-terminalen Amid (Abbildung 1) dividiert wird.

4. Repräsentative Ergebnisse:

Die Caspase-Spaltung und Autophosphorylierung durch SDS-PAGE Commassie Färbung überprüft. Inaktive PAK2 ist eine einzelne Bande von 58 kDa. Caspase Spaltung PAK2 abgeschlossen ist, und erzeugt zwei Fragmente, p27 und p34, die separat zu migrieren. Die Migration von autophosphorylierten p27 und p34 zeigt eine Überlappung auf das Gel aufgrund der verzögerten Migration der vollständig phosphoryliert p27-Fragment (Abbildung 2).

H / D-Austausch Experimente werden mehrmals zwischen 0 und 10 min (Abbildung 3) durchgeführt. Als Beispiel den zeitlichen Verlauf von Deuterium Einbindung in die m / zpeak 1697,85 inaktiver PAK2 besteht aus mehreren Isotopen Gipfel als durch die Verschiebung der Masse Umschlag im Laufe der Zeit gezeigt, zusammen.

Abbildung 1. Gleichung für die Berechnung der Deuterierung.

Abbildung 2. Autophosphorylierung und Caspase Spaltung PAK2. Caspase-abgespalten PAK2 (linke Spur), intakte inaktiv PAK2 (mittlere Spur) und Caspase-abgespalten autophosphorylierten PAK2 (rechte Spur) wurden durch SDS-PAGE und Coommassie-Blau-Färbung analysiert. Angepasst von Hsu, YH et al ^2.

Abbildung 3. Massenspektrum einer zeitlichen Verlauf der Deuterium-Einbau für inaktive PAK2. Inaktive PAK2 wurde H / D excha unterzogennge für 0-10 min und mittels MALDI-TOF. Ein Beispiel für die erweiterte Isotopenverteilung von MALDI-TOF von Peak m / z 1697,85 während der zeitliche Verlauf der H / D-Austausch wird angezeigt. Die rote gestrichelte Linie zeigt den Durchschnitt der Masse Umschlag und die Verschiebung der Masse Umschlag zeigt die Deuterierung eines Peptids.

Diskussion

Bezeichnung des Pepsin-verdauten Fragmente ist ein kritischer Schritt der H / D-Austausch zu experimentieren. Eine falsche Identifizierung des Peptids kann zu einer falschen Schlussfolgerung führen. Pepsin verdaut PAK2 wird durch einen Reverse-Phase-HPLC-C18-Säule eluiert, um einen sauberen Hintergrund zu erhalten. In unseren Experimenten wurden insgesamt 40 Fraktionen gesammelt und einer MALDI-TOF. Multiple Peptide könnten in jeder der Fraktionen identifiziert werden. Die Peptide wurden auf Tandem-Massenspektrometrie (Q-TOF MS / MS und oMALDI MS / MS) unterzogen, um ihre Sequenzen zu identifizieren. Die MS / MS-Spektren eines Peptids sollte mindestens drei Produkt-Ionen, um die Identifizierung des Peptids zu bestätigen.

Der Data Explorer 4.0-Computer-Programm (Applied Biosystems) führt die anfängliche Basislinienkorrektur und Lärm Filtration. Jedes Spektrum ist auf zwei sequenziert Gipfel kalibriert werden. Wir kalibrieren unser Spektrum von der theoretischen Masse des undeuterierten m / z, die 923,45 und 1697,84 sind. Ter Massengenauigkeit nach der Kalibrierung erreichen 10 ppm. Nach Deuterierung kann der Mono-Isotop eine höhere Masse zu verlagern. Unitary Schritt erhöht, um diese m / z-Verhältnissen ergab die verbesserte Massen mit Deuterierung verbunden. Die Peak-Intensitäten der Masse Umschlag wird keinen Einfluss auf die Deuterierung Ebene. Allerdings sind die Peak-Intensitäten der Isotopen-Peaks in einem bestimmten Masse Umschlag von entscheidender Bedeutung für die Berechnung der durchschnittlichen Masse. Der erste Schritt der Berechnung der eingelagerten Deuteronen ist Subtraktion der peptide mass der nicht-deuterierten Probe aus der deuterierten Probe. Drei weitere Faktoren, die D ₂ O verdünnt, die restliche Deuteronen in den Seitenketten und der Rückseite Austausch, müssen weiter in der Berechnung berücksichtigt werden (Abbildung 1). Die D ₂ O ist die Verdünnung Faktor D ₂ O nach dem Mischen der Probe und D ₂ O-Puffer auf die H / D-Austausch zu initiieren. Die verbleibende Deuteron (4,5%) in den Seitenketten der Pepsin-Verdauunged Peptide muss abgezogen werden. Die Back-Austausch ist der unvermeidliche Verlust von Deuterierung in allen deuterierten und Pepsin verdauten Peptide in der Masse Messvorgang.

Die meisten Lösungsmittel zugänglich Peptid (m / z = 1105,60) nach 24-stündiger der H / D-Austausch stellt eine vollständige Deuterierung Region. Die eingearbeiteten Deuteron-Nummer für jedes der Peptide ist der Unterschied zwischen dem Schwerpunkt des deuterierten und nicht deuterierten PAK2 peptischen Peptide. Die am höchsten deuterierten Peptid m / z 1105 wurde ausgewählt, um volle Deuterierung stellen, wenn PAK2 wurde bei 24 Stunden von H / D-Austausch. The Back Exchange Ratio wurde von der tatsächlichen eingebaut Deuteron Zahl bei 24 Stunden von H / D-Austausch mit allen möglichen austauschbaren Stellen im Peptid m / z 1105 dividiert wird.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
D 2 O	Aldrich	7789-20-0
α-cyano-4-Hydroxy-Säure	Sigma	28166-41-8
MALDI-TOF	PE Biosystems	Voyager DE STR
Q-TOF-Massenspektrometer	Q-TOF Ultima-Global
QStar XL oMALDI MS / MS	Applied Biosystems
Data Explorer 4.0-Computer-Programm	Applied Biosystems