Ammide Idrogeno / Deuterio Scambio & massa MALDI-TOF analisi di spettrometria di attivazione Pak2

Riepilogo

MALDI-TOF spettrometria di massa è stato utilizzato con successo per monitorare la amide idrogeno / deuterio in cambio di attivazione della proteina chinasi Pak2.

Abstract

Ammide idrogeno / deuterio scambio (H / D cambio) accoppiata a spettrometria di massa è stata ampiamente utilizzata per analizzare l'interfaccia di interazioni proteina-proteina, i cambiamenti conformazionali delle proteine, la dinamica delle proteine ​​e le interazioni proteina-ligando. H / D cambio sulle posizioni ammidico la spina dorsale è stata utilizzata per misurare i tassi deuterazione delle micro-regioni di una proteina mediante spettrometria di massa ^1,2,3. La risoluzione di questo metodo dipende dalla digestione pepsina deuterati della proteina di interesse in peptidi che normalmente gamma 3-20 residui. Anche se la risoluzione di H / D cambio misurato mediante spettrometria di massa è inferiore alla risoluzione singolo residuo misurata dal eteronucleari singola coerenza quantistica (HSQC) metodo di NMR, la misurazione della spettrometria di massa in H / D cambio non è limitata dalla dimensione del proteine ^​​4. H / D lo scambio avviene in soluzione acquosa che mantiene la conformazione delle proteine. Mettiamo a disposizione un metodo che utilIZES il MALDI-TOF per la rilevazione di ^2, al posto di un HPLC / ESI (ionizzazione electrospray)-MS sistema di ^5,6. Il MALDI-TOF fornisce dati accurati intensità di massa per i peptidi della proteina digerita, in questo caso Pak2 proteina chinasi (detta anche γ-Pak). Proteolisi di Pak 2 è effettuato in una digestione pepsina non in linea. Questo metodo alternativo, quando l'utente non ha accesso a una colonna HPLC e pepsina collegato alla spettrometria di massa, o quando la colonna pepsina in HPLC non si traduca in una mappa digestione ottimale, per esempio, il pesante disolfuro-bonded secreto fosfolipasi A ₂ (SPLA _2). Utilizzando questo metodo, abbiamo monitorato con successo i cambiamenti nel livello deuterazione durante l'attivazione della caspasi 3 Pak2 di scissione e autofosforilazione ^7,8,9.

Protocollo

1. Pak2 attivazione

1. Aggiungere l'appropriato pre-testati quantità di caspasi 3-20 l di 12 mg / ml Pak2 nel buffer A (50 mM DTT mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, e 2 a pH 7,5) e incubare a 34 ° C per 30 min a pieno fendere e attivare Pak2.
2. Analizzare i prodotti di scissione mediante SDS-PAGE (10%) e Coommassie colorazione blu.
3. Aggiungere il Pak2 spaccati di attivazione del buffer B (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 15 mM MgCl _2, 10 mM ATP) a pH 7,5, in 20 microlitri di una concentrazione finale di 10 mg / ml Pak2, e incubare a 34 ° C per 30 minuti per attivare completamente Pak2 da autofosforilazione a 8 siti.
4. Conferma scissione completa di Pak2 dalla migrazione dei frammenti p34 e p27 come determinato dalla SDS-PAGE ^10. Un'adeguata verifica delle condizioni autofosforilazione avviene tramite autoradiografia in un esperimento separato con ⁽³² P) ATP o spettrometria di massa per rilevare fosfopeptidi.

2. Identificazionedi pepsina-digerito Pak2 Frammenti

1. Aggiungere 1 ml di 0,1% Acido Trifluroacetic (TFA) a pH 2,5 a lavare le perline agarosio due volte prima dell'uso. Poi, centrifugare i campioni per 15 sec a 2.000 xg per rimuovere le perline.
2. Aggiungi Pak2 (20 mg in 2 ml di 150 mM NaCl, 50 mM DTT mM Tris-HCl e 2 a pH 7,5) a 100 ml di 0,1% TFA, e incubare il campione per 5 minuti con 30 ml di pepsina-coniugato perline agarosio .
3. Equilibrare una inversione di fase colonna HPLC C18 con un sistema primario di solvente 0,1% TFA a pH 2.5. Il digest pepsina (50 ml) viene eluito con un lineare da 100 min gradiente di 0-80% acetonitrile contenente 0,1% TFA ad un flusso di 0,2 ml / min. Le frazioni vengono raccolti ogni 2 min.
4. Asciugare le frazioni HPLC con uno speed-vac (3 h) e risospendere i campioni in una soluzione di acetonitrile (5 mL) e lo 0,1% TFA (5 mL) a pH 2.5.
5. Inizialmente, ogni frazione è a screening per peptidi con il MALDI-TOF PerSeptive Biosystems Voyager DE STR (PE Biosystems, Foster City, CA, USA).
6. Le 16 frazioni contenenti peptidi sono sottoposti a spettrometria di massa tandem con un Q-TOF spettrometro di massa e un QSTAR XL oMALDI MS / MS per identificare i frammenti.
7. La sequenza di ciascun peptide è verificata dagli ioni prodotto generato dalla spettrometria di massa tandem con il teorico m / z coefficienti basati sulla sequenza principale del Pak2 Usando il sito web Protein Prospector ( http://prospector.ucsf.edu/ ) ^11.

3. Misura della Amide H / D Cambio

1. Tenere tutte le soluzioni e reagenti necessari per H / D cambio a 25 ° C a bagnomaria. ATP viene disciolto in acqua e il pH è regolato a 7,0 prima dell'uso. L'ulteriore 4mm ATP in D ₂ O buffer è di impedire ATP dissociato dal Pak2 dopo la diluizione.
2. Avviare H / D scambio con l'aggiunta di 18 ml di tampone D ₂ O (50 mM MOPS pH 6,98, 125 mM NaCl) a 2 microlitri (20 mcg) Di Pak2 in un tampone contenente 150 mM NaCl, 50 mM mM Tris-HCl (pH 7,5) e 2 DTT, che comporti un livello Pak2 di 10 mg / ml e un pH di 7,0 a 0 ° C.
3. Incubare i campioni in triplice copia in H / D cambio di 0, 0,5, 1, 3, 5 e 10 minuti, o 24 ore
4. Estinguere la H / D processo di scambio con l'aggiunta di 180 ml di ghiacciata TFA 0,1% a pH 2.2, che porta il pH a 2,5 in un volume finale di 200 l. Per i campioni contenenti ATP, 180 ml di ghiacciata TFA 0,11% a pH 2.2 è utilizzato per mantenere il pH a 2,5 in stato bonificato.
5. Aggiungere un'aliquota (100 l) di ciascun campione spento a 30 ml di pepsina attivata coniugato perline agarosio. La digestione pepsina è autorizzato a procedere su ghiaccio per cinque minuti ed i campioni sono in agitazione ogni 30 sec.
6. Terminare la digestione per centrifugazione del campione per 15 sec a 5.000 xga 4 ° C per rimuovere la pepsina.
7. Congelare rapidamente i campioni in liquido N ₂ e conservare a -80 ° C per non più di 2giorni prima della MALDI-TOF analisi.
8. La matrice di MALDI è di 5 mg / ml di α-ciano-4-idrossicinnamici acido (CHCA) disciolto in una soluzione (1:1:1) di acetonitrile, etanolo e 0,1% TFA a pH 2,5 e tenuto a 0 ° C.
9. Parzialmente scongelare rapidamente ogni campione e mescolare 1 ml di ogni campione con 1 l di matrice e spot su un 4 ° C Piastra MALDI.
10. Applicare un vuoto moderato al piatto ad asciugare i punti in 30 secondi prima di MALDI-TOF analisi. Il tempo tra scongelamento del campione e il recupero dello spettro è di circa 3 min.
11. Acquisire MALDI-TOF spettri di massa con un PerSeptive STR Biosystems Voyager DE. Acquisire dati in un 2-GHz, frequenza di campionamento a 100.000 canali di dati, con un 20.000 V tensione di accelerazione, e una tensione di rete del 65% utilizzando l'estrazione con un ritardo di 180 ns ritardo impulsi. Un centinaio di scansioni sono in media di 2 min. Il MALDI-TOF strumento non si limita a qualsiasi marca o software particolari.
12. Utilizzare il programma per computer Data Explorer 4.0 per calculmangiato la deuterazione di ogni frammento.
13. Calcolare il cambio posteriore in base al rapporto del numero effettivo deuterone incorporata a 24 ore di H / D cambio divisa per tutti i siti possibili intercambiabili, che sono la spina dorsale amidi, tranne N-terminale ammide (Figura 1).

4. Rappresentante dei risultati:

La scissione della caspasi e autofosforilazione sono verificati mediante SDS-PAGE colorazione Commassie. Pak2 inattive è una singola banda di 58 kDa. Scissione della caspasi Pak2 è completa, e produce due frammenti, p27 e p34 che migrano separatamente. La migrazione di autophosphorylated p27 e p34 mostra una sovrapposizione sul gel a causa della ritardata migrazione del frammento completamente fosforilati p27 (Figura 2).

H / D esperimenti di cambio vengono effettuate più volte tra 0 e 10 min (Figura 3). A titolo di esempio, la durata d'incorporazione deuterio in m / ZPEAK 1697,85 di Pak2 inattivi è composto da più picchi isotopici, come indicato dallo spostamento della busta di massa nel corso del tempo.

Figura 1. Equazione per il calcolo del deuterazione.

Figura 2. Autofosforilazione e scissione delle caspasi Pak2. Caspasi-spaccati Pak2 (corsia di sinistra), intatto Pak2 inattiva (corsia centrale) e della caspasi-spaccati autophosphorylated Pak2 (corsia di destra) sono stati analizzati mediante SDS-PAGE e Coommassie colorazione blu. Adattato da Hsu, YH et al ^2.

Figura 3. Spettro di massa di un corso momento della costituzione di deuterio per Pak2 inattivi. Pak2 inattivo è stato sottoposto a H / D SCAMBIOESN per 0-10 min e analizzati da MALDI-TOF. Un esempio della distribuzione isotopica del ampliato MALDI-TOF di picco m / z 1697,85 durante il periodo di tempo di H / D scambio è mostrato. La linea rossa tratteggiata indica la media della busta di massa e lo spostamento della busta di massa mostra il deuterazione di un peptide.

Discussione

Identificazione della pepsina-digerito Frammenti è un passo fondamentale della H / D esperimento di scambio. Identificazione errata del peptide può condurre a conclusioni errate. Pak2 pepsina-digerito viene eluito in una colonna HPLC in fase inversa C18 per ottenere un fondo pulito. Nei nostri esperimenti, un totale di 40 frazioni sono state raccolte e sottoposte a MALDI-TOF. Peptidi multipli potrebbero essere identificati in ciascuna delle frazioni. I peptidi sono stati sottoposti a spettrometria di massa tandem (Q-TOF MS / MS e oMALDI MS / MS) per identificare le loro sequenze. La MS / MS spettri di un peptide dovrebbe avere almeno tre ioni prodotto per confermare l'identificazione del peptide.

Il programma per computer Data Explorer 4.0 (Applied Biosystems) esegue la correzione iniziale di base e filtraggio del rumore. Ogni spettro deve essere calibrata sulla base di due picchi in sequenza. Noi calibrare il nostro spettro da parte della massa teorica del undeuterated m / z che sono 923,45 e 1697,84. Tlui accuratezza di massa dopo la calibrazione può raggiungere i 10 ppm. Su deuterazione, il mono-isotopo può passare ad una massa maggiore. Aumenta passo unitario a questi m / z rapporti ceduto le masse associate a una maggiore deuterazione. L'intensità dei picchi della busta di massa non influisce sul livello deuterazione. Tuttavia, l'intensità dei picchi dei picchi isotopici in una busta di massa particolare sono fondamentali per il calcolo della massa media. Il primo passo del calcolo del deutone è incorporato sottraendo la massa del peptide non deuterati campione dal campione deuterato. Tre altri fattori, la diluizione D ₂ O, il deuteroni residuo nelle catene laterali e il cambio posteriore, dovranno essere ulteriormente considerati nel calcolo (Figura 1). La diluizione D ₂ O è il fattore di diluizione D ₂ O dopo la miscelazione del campione e D ₂ O di buffer di avviare la H / D cambio. Deutone residua (4,5%) nelle catene laterali della pepsina-digerirepeptidi ed ha bisogno di essere sottratto. Il back-scambio è l'inevitabile perdita di deuterazione in tutti i peptidi deuterato e pepsina-digerito nel processo di misura di massa.

Il peptide più accessibile solvente (m / z = 1105,60) dopo 24 ore di H / D cambio rappresenta una regione ricca deuterazione. Il numero deuterone incorporato per ciascuno dei peptidi è la differenza tra il baricentro dei peptidi deuterati e non deuterati peptica Pak2. Il più grande deuterati peptide m / z 1105 è stato selezionato per rappresentare deuterazione piena quando Pak2 era a 24 ore di H / D cambio. Il Rapporto di Cambio posteriore è stato calcolato il numero effettivo deuterone incorporata a 24 ore di H / D cambio divisa per tutti i siti possibili scambiabile a peptide m / z 1105.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
D 2 O	Aldrich	7789-20-0
α-ciano-4-acido idrossicinnamici	Sigma	28166-41-8
MALDI-TOF	PE Biosystems	Voyager DE STR
Q-TOF Spettrometro di massa	Q-TOF Ultima-Global
QSTAR XL oMALDI MS / MS	Applied Biosystems
Dati Explorer 4.0 programma per computer	Applied Biosystems