Determinación rápida del umbral nociceptivo térmico en ratas diabéticas

Resumen

A continuación, describimos un procedimiento rápido fiable y sencillo para determinar la temperatura más baja en la que las ratas o ratones muestran un comportamiento nocifensive, Es decir, El Umbral nociceptivo térmica (TNT). Este método se aplica un estímulo térmico aumentando lentamente permitiendo una estimación precisa y reproducible de TNTS con un mínimo, en su caso, la tensión a los animales.

Resumen

La neuropatía diabética dolorosa (PDN) se caracteriza por la hiperalgesia, es decir, mayor sensibilidad a los estímulos nocivos, y la alodinia, es decir, hipersensibilidad a estímulos inocuos normalmente ^1. Hiperalgesia y alodinia se han estudiado en muchos diferentes modelos de roedores de la diabetes mellitus tipo ^2. Sin embargo, según lo declarado por Bölcskei et al, la determinación de "dolor" en modelos animales es un reto debido a su naturaleza subjetiva ^3. Por otra parte, los métodos tradicionales utilizados para determinar las respuestas de comportamiento a los estímulos térmicos nocivos por lo general carecen de reproducibilidad y la sensibilidad farmacológica ^3. Por ejemplo, utilizando el método de la placa caliente de Ankier ^4, estremecerse, la retirada y / o de cualquiera de lamer traseros y / o patas delanteras se cuantifica como los reflejos en las latencias de constantes estímulos térmicos de alta (52-55 ° C). Sin embargo, los animales que son hiperalgésico al estímulo térmico no reproducible muestran diferencias en la reflex latencias que se utilicen los umbrales de temperaturas ^supra-3,5. Como el método descrito recientemente de Bölcskei et al. ^6, los procedimientos descritos aquí permite la determinación rápida, sensible y reproducible de los umbrales térmicos nociceptivos (TNTS) en ratones y ratas. El método utiliza estímulo aumentando lentamente térmico aplicado principalmente a la piel de la superficie de ratón / rata plantar. El método es especialmente sensible para estudiar la lucha contra la nocicepción durante los estados hiperalgésicas como PDN. Los procedimientos descritos abajo se basan en los publicados en detalle por Almási et al ⁵ y Bölcskei et al ^3. Los procedimientos aquí descritos han sido aprobados el Cuidado de Animales de Laboratorio y el empleo (LACUC), Wright State University.

Protocolo

TNTS de ratones y ratas se determinan mediante el incremento de la placa caliente analgesia metros [iHPAM, CITI Inc. Ciencias de la Vida (Woodland Hills, CA)]. El equipo consta de varios componentes: una placa de aluminio (10 x 20 cm) con el sistema de calefacción por debajo y una cámara de observación por encima de plexiglás, una unidad de control de calor, el software de adquisición de datos (serie CITI Parte # Soft 8), una PC (personal ordenador) y un pedal de arranque a control remoto, detener o reiniciar el control de la unidad. El sistema de calefacción también permite el inicio / parada / reposición del proceso de calentamiento de forma manual a través de un teclado en frente del equipo. El iHPAM se puede configurar para diferentes velocidades de calentamiento, en espera / de corte de las temperaturas.

1. Instalación del equipo

1. Antes de los animales de prueba, una inspección visual de la unidad para corroborar las tasas de calentamiento elegido (por ejemplo, 6 ° C / min), las temperaturas iniciales y finales en espera de corte (por ejemplo, 28 ° C y 55 ° C, respectivamente).
2. Verifique todas las conexiones. Para conservar una copia electrónica de los resultados, la unidad debe estar conectada a un ordenador con software de la serie 8. Por otra parte, las copias impresas de los resultados se pueden imprimir a través del puerto serie de la unidad.
3. Pruebe el equipo. Pulse el pedal una vez para asegurarse de que el Software Series 8 registros de datos: las temperaturas iniciales de reserva, de corte final y el tiempo en segundos requerido para alcanzar la temperatura de corte.
4. Como una prueba de control adicional, los investigadores que participan en los experimentos puede ser necesario experimentar el dispositivo en sí mismos. Retiro de la mano de la placa de metal en el momento de la percepción del dolor (46-48 ° C) no debe causar daño a la piel ni produce ninguna molestia posterior.
5. Una vez que la unidad se ha establecido y se registrarán los resultados de las medidas 1.3 y 1.4 se pueden comparar. Esto es útil para detectar problemas potenciales que podrían invalidar el uso de la unidad. Por ejemplo, las discrepancias entre la formación inicial de espera / final de corte Tempeperaturas y la lectura real de la unidad, y / o diferencias entre las temperaturas mostradas por la unidad y la temperatura de la placa real requerido para la retirada de la mano.

2. Prueba de los animales normales

Ya sea joven o adulto ratas Wistar [post-parto (p) Edad 21-25 días], o los ratones (P21-25) de cualquier fondo genético o de género se puede utilizar. Los ratones usados ​​en nuestros experimentos son de la cepa C57BL/6J.

1. La noche antes de los experimentos a realizar, aclimatar a los animales mediante la colocación de sus jaulas en el banco donde se encuentra el iHPAM. Dos horas antes de la realización de las pruebas, encienda el iHPAM para familiarizar a los animales con el ruido de fondo de la unidad. En este punto, el iHPAM se puede configurar y probados para verificar el correcto funcionamiento (consulte los pasos 1). Alimentos y el agua se proporcionaron ad libitum durante toda la prueba, excepto cuando el animal se encuentra en la cámara de observación (ver Paso 2.1).
   Nota: Es importante no asumir que las condiciones de laboratorio en experimentos de comportamiento son controlados de forma predeterminada. Se debe prestar especial atención a los factores genéticos y ambientales que pueden influir en los resultados de los estudios de comportamiento (revisado en ^7).
2. Suavemente colocar un ratón normal / rata en la cámara de observación plexiglás en la parte superior de la placa de calentamiento de la unidad. Deje que el animal se adapte a la superficie caliente (fijado en 28 ° C) hasta que el animal muestra un comportamiento confortable.
   Nota: En estas condiciones las ratas normales adultas muestran un comportamiento exploratorio inicial, en ocasiones de pie hacia la tapa de la cámara de observación, mientras que oler. Después de unos minutos, las ratas pueden presentar episodios ocasionales de aseo personal y un comportamiento relajado. A veces, las ratas se acostó con una postura corporal relajada (extensión de decúbito prono), mientras que casualmente olfatear los alrededores. Los ratones normales son generalmente más activos que las ratas. Sin embargo, los ratones muestran un comportamiento exploratorio, relajado después de unos minutos in la cámara de observación. Es excepcionalmente raro observar tanto las conductas de escape (por ejemplo, saltar, tratando de escapar de la cámara de observación) o actitudes defensivas (por ejemplo, chillando). Es también importante observar que los ratones pueden comunicar el dolor de un ratón a otro ^8. Por lo tanto, puede ser importante para los ratones de prueba colocados en jaulas separadas.
3. Colocar espejos en la parte posterior de la cámara de observación, para permitir observaciones en todos los ángulos. Un trípode que sostiene una cámara de vídeo digital puede ser de gran ayuda para determinar el momento exacto en el que nocifensive (evitar el dolor) la conducta que había ocurrido.
4. Una vez que el animal está cómodo en el calor de la cámara de observación de la placa presionando el pedal. Cuando la temperatura de la placa se calienta a una velocidad de 6 ° C / min, los animales normales presentan un comportamiento nocifensive estén implicados tanto la pata trasera-* Por lo general las temperaturas que rabian 46 a 48 ° C ^3,5,9,10. Por lo tanto, el animal es la forma típica eliminado la observablesción cámara después de aproximadamente 3 minutos.
   Nota: Para la respuesta típica de un nocifensive es decir, la rata o el ratón, pata posterior paliza, mientras se agita y / o de elevación, es suficiente para terminar el estímulo térmico. Esto se consigue presionando el pedal. En este momento, el software registra la temperatura de la placa y la placa inmediatamente se enfría hasta la temperatura de espera (28 ° C) se alcanza (~ 0,5 min). Esto es decir, la temperatura, la que evoca cualquier reacción nocifensive es considerado como el umbral de calor nocivo (TNT) de la normal (control) de los animales.
   * A veces, particularmente en los ratones, el comportamiento a la temperatura nocifensive nocivo primero se puede observar en una o ambas patas delanteras (por ejemplo, lamiendo mientras está sentado), segundos antes traseras de las patas. Sin embargo, la pata delantera se lame es un componente normal de la conducta de aseo. Por lo tanto, sólo pata posterior se evalúan las reacciones. En ocasiones, los ratones pueden preparar a sus patas traseras también. Sin embargo, la preparación normal de hacer not duran más de unos pocos segundos, no implica intensiva lamer y por lo general termina después de la limpieza de sus garras.
5. Retire con cuidado el animal de la placa y colocarla en su jaula correspondiente. La medición del umbral de calor se repite entonces para el control de otras (normal) de los animales.
   Nota: TNTS se puede determinar en un solo animal a intervalos de 1-2 minutos sin retirar el animal de la cámara de observación. Determinaciones de TNT en ratas o ratones puede repetirse varias veces durante varios días. Esto es particularmente útil para determinar la media de TNT de un animal individual, así como su variación con la edad.
6. El TNT de los animales de control se expresa como la media de tres o más umbrales ± SEM.
7. El análisis estadístico de los datos obtenidos se realizó para comparar los diferentes grupos de tratamiento de los ratones o ratas. Procedimientos paramétricos, incluyendo análisis de la varianza puede ser utilizado apropiadamente en donde los datos se distribuyen normalmente y donde los grupos de tratamiento son homoskedastic, cuando estas condiciones se han cumplido los siguientes criterios pueden ser aplicados. Análisis de varianza seguido por la prueba de Newman-Keuls para detectar diferencias en las mediciones múltiples, es decir, que se repiten TNTS individuales con / sin tratamiento o en diferentes puntos de tiempo (por ejemplo, datos de la Figura 3). El Student para datos apareados t-test se puede utilizar para comparar dos grupos de datos es decir, antes de TNTS después del tratamiento contra las drogas, el unpaired t-test se puede utilizar para determinar las diferencias en los cambios de TNT en tratados con el fármaco frente a animales tratados con vehículo (por ejemplo, , datos de la Figura 4).

3. Prueba de los animales diabéticos

La estreptozotocina (STZ) inducida rata diabética es el modelo animal más utilizado para estudiar los mecanismos de PDN y evaluar fármacos analgésicos y terapias ^11,12. Las ratas hechas diabéticas por una sola dosis intraperitoneal de STZ (60 mg / kg) puede be la prueba de la hiperalgesia térmica durante la 3 ^ª semana después de la aparición de la diabetes ^11. Es importante tener en cuenta que no todas las ratas diabéticas desarrollar PDN. Sin embargo, los animales que se desarrollan hiperalgesia (~ 50%) pueden ser fácilmente identificados. De hecho, sus TNTS son inferiores a lo normal *.

* Para determinar TNTS de STZ ratas diabéticas, una temperatura de la placa de partida de 15 ° C en lugar de 28 ° C se utiliza. La razón de estos cambios es que los animales diabéticos con más PDN se espera que sean hiperalgésico ^2,11. Por lo tanto, tendrán más bajos que los umbrales normales de calor nocivos (por ejemplo, <45 ° C).

1. Una rata diabética se coloca en la cámara de observación en la parte superior del aparato de ensayo. El animal se le permite aclimatarse a la superficie de la placa hasta que el animal muestra un comportamiento confortable.
   Nota: Por lo general, una rata diabética no muestra gran parte del comportamiento normal. Las ratas diabéticas suelen ser hipoactivo, letárgico, a menudo mostrandomovimientos restringidos y aseo lento. Es raro observar la clasificación hacia la tapa de la cámara de observación. Después de unos minutos, las ratas diabéticas con calma pueden permanecer en un rincón de la cámara con ocasional inhalación de los alrededores.
2. Una vez que el animal diabético es cómodo en la cámara de observación, la placa se calienta hasta que en la Etapa 2,3 la rata diabética pueden mostrar un comportamiento nocifensive implica ya sea trasera / delantera de la pata. Esto suele ocurrir a temperaturas de la placa no nocivos (por ejemplo, <45 ° C), o después de no más de 5 minutos en la cámara con el aumento de la temperatura de 6 ° C / min.
   Nota: La respuesta nocifensive de una rata adulta joven diabético no difiere de la de una rata normal. Sin embargo, la temperatura más baja que evoca tal comportamiento se redujo significativamente.
3. Vea el Paso 2.4
4. La media de más de tres umbrales en el día del experimento expresado como ° C ± SEM se considera el umbral de calor nocivo de la diabetic animal.
   Nota: Un paradigma similar a la explicada para las ratas normales o diabéticas se pueden seguir para determinar la eficiencia térmica de lucha contra la nocifensive efecto de los analgésicos en los umbrales de calor.

4. Las pruebas de analgesia

Las propiedades anti-nociceptivos de fármacos (por ejemplo, analgésicos), así como la determinación de los parámetros farmacológicos tales como la dosis mínima efectiva puede ser fácilmente obtenido mediante los pasos explicados anteriormente. Se prevé que las dosis apropiadas de un analgésico administrado a ratas o ratones incrementaría significativamente sus TNTS. Esto es particularmente sensible en los animales con hiperalgesia térmica ^3. Sin embargo, para evitar el sesgo en la interpretación de los resultados, los investigadores involucrados en la observación del comportamiento de un grupo de animales que no debe saber o conocer si los animales habían sido tratados o no. Además, los medicamentos a ser inyectados por el observador se pueden preparar por otro investigador y etiquetadosA, B, C, etc dosificación se proporciona en una copia impresa, listando dosis individuales por animal identificado.

Dependiendo del fármaco sometido a ensayo, diferentes dosis de un analgésico potencial puede ser administrado a los animales normales o diabéticos 5-15 min comportamiento pruebas anteriores. Los controles apropiados deben ser incluidos (es decir, solo emparejados por edad los animales inyectados con vehículo y / o ratas diabéticas sin PDN) y probada usando condiciones idénticas (por ejemplo, misma temperatura de partida de la placa). Los efectos crónicos de drogas se puede probar también.

5. Los resultados representativos

La temperatura más baja de la placa que evoca reacciones nocifensive, ya sea en la pata trasera de jóvenes adultos normales no tratados ratas o ratones se determinaron los pasos siguientes 2-1 a 2-6. Como se muestra en la Figura 1, TNT de ratas normales y ratones adultos jóvenes fueron 47,2 ± 0,2 ° C y 47,5 ± 0,5 ° C, respectivamente.

Tenemos OBSErved ni variación significativa diaria de TNTS individuo (Figura 2A), ni cambios significativos de TNTS entre los individuos de la misma edad (Figura 2B). Diferencias TNT, debido a los géneros no se observaron (no mostrado).

TNTS de jóvenes adultos STZ-ratas diabéticas se determinaron de manera similar a la de las ratas normales (Pasos 3.1 a 3.3). Sin embargo, la temperatura de la placa de partida se fijó a 15 ° C en lugar de 28 ° C. El comportamiento nocifensive de STZ-ratas diabéticas se evaluó al menos tres veces en un individuo y de manera diaria a partir once días después de la inyección de STZ. Como se muestra en la Figura 3, una disminución significativa (p <0,01) en el TNT de STZ-ratas diabéticas se hace evidente dos semanas después de la inyección de STZ. La media de TNT de STZ-ratas diabéticas fue de 45,6 ± 0,1 ° C (n = 16, los valores combinados de 14-23 días).

Las ratas diabéticas que presentan significativamente más baja que la norma TNTl se considera que tienen PDN. Estas ratas se utilizaron para probar las agudas antinociceptivos propiedades de un analgésico (compuesto A). TNTS se determinaron en ratas normales y diabéticas inyectados con una dosis única del compuesto o vehículo solo cinco minutos antes de la prueba. Como se muestra en la Figura 4, una sola dosis intraperitoneal del compuesto aumentó significativamente TNTS de ratas diabéticas, en comparación con ratas tratadas con el vehículo solo (45,6 ° C frente a 47,6 ° C, respectivamente). El efecto anti-nocifensive del compuesto A también se observó en las ratas normales, aunque significativa (p <0,01), fue menos pronunciada (47,4 ° C frente a 48,0 ° C, respectivamente).

Figura 1. Determinación de TNTS de ratas adultas jóvenes normales y ratones: Los TNTS de ratas adultas jóvenes (p21-24) o ratones (P20-21) fueron probados en el iHPAM siguiendo los pasos descritos ABOve. Un total de 12 ratas y ratones fueron probados 25. Las mediciones se realizaron durante varios días y los resultados se agruparon. Los resultados se expresan como media ± SEM. El mínimo y el máximo de los valores registrados en TNT estas ratas fue de 46,2 ° C y 48,6 ° C respectivamente. En el caso de los ratones, los valores máximo y mínimo de TNT registrados fueron 48,8 ° C y 44,9 ° C, respectivamente.

Figura 2. Edad-dependencia de TNTS en ratas y ratones: Un Plotted) son los TNTS de cuatro ratas normales (n = 4) de 21 días de edad determinados por lo menos tres veces al día durante 5 días B) TNTS de ratones littermates determinarse una vez al indicado. las edades. Los números en la parte superior de cada determinación del punto representa el número de camada utilizados.

Figura 3. Las ratas diabéticas se hiperalgésico 3 noseks después de la aparición de la diabetes: TNTS de seis (n = 6) años de edad encontrados adultos jóvenes STZ-ratas diabéticas se determinaron todos los días desde 11 días después de la inducción de la diabetes. Se muestran los promedios diarios de TNT (media ± SEM). TNTS diabéticos determinadas entre 11-13 días después de la inyección de STZ se encontraban dentro del rango normal (línea roja). Dos semanas después de la inyección de STZ TNTS disminuyó significativamente a 45,1 ± 0,4 ° C, (p <0,05).

Figura 4. Agudas contra nocifensive efectos del compuesto B en ratas diabéticas STZ. Ratas jóvenes adultos normales (azul grupo de n = 12) y la edad coincide con STZ-ratas diabéticas (verde hiperalgésicas grupo n = 6) fueron probados en el iHPAM después de la inyección intraperitoneal de vehículo (barras oscuras) o un compuesto. (barras claras) La media de TNT ± SEM para cada tratamiento (control del vehículo o el compuesto A-tratada) se muestran. Los asteriscos indican diferencias estadísticas(P <0,05).

Discusión

Al igual que en la prueba de la placa clásico caliente para cuantificar la hiperalgesia térmica ^4,13, el ensayo de la nocicepción aquí descrito permite una manera rápida y fiable para cuantificar el comportamiento nocifensive en ratas y ratones. Sin embargo, contrariamente a prueba clásica, el incremento de la placa caliente método es no invasivo y prácticamente libre de estrés. Aunque algunos frenar es necesario realizar la prueba (es decir, el animal debe estar en la cámara de observació...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre	Empresa	Número de catálogo
Incremento de la placa caliente Analgesia Meter	CITI Inc. Ciencias de la Vida	Parte # PE34
Serie suave 8	CITI Inc. Ciencias de la Vida	Parte # Series8
Estreptozotocina	Calbiochem	572201