Determinação rápida do limiar térmico nociceptivo em ratos diabéticos

Resumo

Aqui, nós descrevemos um procedimento rápido, simples e confiável para determinar a menor temperatura em que ratos ou camundongos mostram comportamento nocifensive, Ou seja, O Limiar térmico nociceptivo (TNT). Este método aplica-se um estímulo aumentando lentamente térmica permitindo estimativa precisa e reprodutível de TNTs com mínima, se alguma, o stress para os animais.

Resumo

Neuropatia diabética dolorosa (PDN) é caracterizada por hiperalgesia isto é, aumento da sensibilidade à estímulo nocivo, e isto é alodinia, hipersensibilidade a estímulos inócuos normalmente ^1. Hiperalgesia e alodinia têm sido estudados em muitos modelos de roedores diferentes de diabetes mellitus ^2. No entanto, como afirma Bölcskei et al, a determinação de "dor" em modelos animais é um desafio devido à sua natureza subjetiva ^3. Além disso, os métodos tradicionais utilizados para determinar as respostas comportamentais a estímulos térmicos nocivos geralmente não possuem reprodutibilidade e ³ sensibilidade farmacológica. Por exemplo, usando o método de placa quente de Ankier ^4, recuar, retirada e / ou lamber de qualquer posterior e / ou fore-patas é quantificada como latências do reflexo na elevada e constante estímulos térmicos (52-55 ° C). No entanto, os animais que são de hiperalgesia ao estímulo térmico não reproduzível mostrar diferenças em relatências Flex usando essas temperaturas supra-limiar de ^3,5. Como o método descrito recentemente de Bölcskei et al. ^6, os processos descritos aqui permite a determinação rápida, sensível e reprodutível de térmicas limiares nociceptivos (TNTs) em ratinhos e ratos. O método utiliza a aumentar lentamente estímulo térmico aplicado principalmente para a pele de rato / rato superfície plantar. O método é particularmente sensível a estudar anti-nocicepção durante estados de hiperalgesia tais como PDN. Os procedimentos descritos abaixo são baseados em os publicados em detalhe por Almasi et al ⁵ e et al Bölcskei ^3. Os procedimentos descritos aqui foram aprovados o Animal Care Laboratório e do Comitê de Uso (LACUC), Wright State University.

Protocolo

TNTs de ratinhos e ratos são determinados usando o incrementais placa quente analgesia metros [iHPAM, Inc. IITC Life Science (Woodland Hills, CA)]. O equipamento consiste em vários componentes: uma placa de alumínio (10 x 20 cm) com o sistema de aquecimento por baixo e uma câmara de observação Plexiglas acima; uma unidade de calor controlar, o software de aquisição de dados (IITC Série Parte # suave 8), um PC (pessoal computador) e um pedal de partida remota, parar ou reiniciar o controle da unidade. O sistema de aquecimento também permite iniciar / parar / reposição do processo de aquecimento manualmente através de um teclado, em frente do equipamento. O iHPAM pode ser configurado para taxas de aquecimento diferentes, espera / corte temperaturas.

1. Equipamento Set-up

1. Antes de animais de ensaio, inspeccione visualmente a unidade para corroborar as taxas de aquecimento escolhido (por exemplo, 6 ° C / min), inicial e final temperaturas de espera de corte (por exemplo, 28 ° C e 55 ° C, respectivamente).
2. Verifique todas as conexões. Para manter uma cópia eletrônica dos resultados, a unidade deve ser ligada a um computador com Software Series 8. Alternativamente, cópias dos resultados podem ser impressos através da porta serial da unidade.
3. Testar o equipamento. Pressione o pedal uma vez para certificar-se da série Software 8 registros dos dados: inicial de espera, as temperaturas de corte final e tempo em segundos necessários para atingir a temperatura de corte.
4. Como um teste de controlo adicional, os investigadores envolvidos nas experiências podem necessitar de experimentar o dispositivo em si mesmos. Levantar a mão da placa de metal no momento da percepção da dor (46-48 ° C) não deve nem causar danos à pele nem produzir qualquer desconforto depois.
5. Uma vez que a unidade tenha sido definida e os resultados dos passos 1.3 e 1.4 registada eles podem ser comparados. Isto é útil para detectar problemas potenciais que podem invalidar a utilização da unidade. Por exemplo, as discrepâncias entre inicial de espera / final cut-off temperatures ea leitura efectivo da unidade, e / ou diferenças entre as temperaturas indicadas pela unidade ea temperatura da placa real necessário para a retirada mão.

2. Testando animais normais

Ou jovens ou adultos ratos Wistar [pós-natal a idade (p) 21-25 dias], ou ratinhos (p21-25) de todo o fundo genético ou do género podem ser usados. Os ratinhos usados ​​nas nossas experiências são da estirpe C57BL/6J.

1. Na noite antes das experiências a ser executada, aclimatar os animais, colocando as suas gaiolas no banco onde o iHPAM é colocado. Duas horas antes de realizar os testes, ligue o iHPAM para familiarizar os animais com o ruído de fundo da unidade. Neste ponto, o iHPAM pode ser ajustado para cima e testados para verificar a função apropriada (ver Passos 1). Alimentos e água são fornecidas ad libitum durante todo o teste, exceto quando o animal está na câmara de observação (ver passo 2.1).
   Nota: É important não assumir que as condições de laboratório em experimentos comportamentais são controlados por padrão. Especial atenção deve ser dada aos fatores genéticos e ambientais que podem influenciar o resultado dos estudos comportamentais (revisto em ^7).
2. Suavemente colocar um rato normal / rato na câmara de observação Plexiglass no topo da placa de aquecimento da unidade. Permitir que o animal se adapte à superfície aquecida (definido a 28 ° C) até que o animal mostra um comportamento confortável.
   Nota: Sob estas condições ratos adultos normais apresentam um comportamento exploratória inicial, ocasionalmente levantando-se para a tampa da câmara de observação, enquanto que sniffing. Depois de alguns minutos, os ratos podem mostrar bouts casuais de preparação e um comportamento relaxado. Às vezes, os ratos se deitou com uma postura relaxada (extensão prone), enquanto casualmente farejando os arredores. Camundongos normais geralmente são mais ativos do que ratos. No entanto, os ratos apresentam um comportamento exploratório relaxado depois de alguns minutos iN a câmara de observação. É excepcionalmente raro observar tanto comportamentos Fuga (por exemplo, pulando, tentando escapar da câmara de observação) ou atitudes defensivas (por exemplo, gritando). Também é importante notar que os ratos podem se comunicar a dor de um rato para outro ^8. Por isso, pode ser importante para ratos de teste colocados em gaiolas separadas.
3. Colocar espelhos na parte de trás da câmara de observação, para permitir observações em todos os ângulos. Um tripé segurando uma câmera de vídeo digital pode ser de ajuda para determinar o momento exato em que o comportamento (evitar a dor) nocifensive havia ocorrido.
4. Uma vez que o animal está confortável no calor câmara de observação até a placa pressionando o pedal. Quando a temperatura da placa aquece a uma taxa de 6 ° C / minuto, os animais normais exibem um comportamento nocifensive envolvendo quer pata traseira-* Geralmente temperaturas fúria 46-48 ° C ^3,5,9,10. Assim, o animal é removido forma típica o observcâmara de ation após aproximadamente 3 minutos.
   Nota: Observando a resposta típica de um nocifensive ou seja rato ou mouse, pata-hind lambendo, agitando e / ou de elevação, é suficiente para encerrar o estímulo térmico. Isto é conseguido, premindo o interruptor de pé. Neste momento, o software grava temperatura da chapa ea placa imediatamente arrefece até que a temperatura de espera (28 ° C) for atingido (~ min 0,5). Este ie temperatura, o que evoca uma qualquer reacção nocifensive é considerado como o limiar de calor nocivo (TNT) do animal (controle) normal.
   * Por vezes, particularmente em ratinhos, o comportamento nocifensive à temperatura nocivo pode primeiro ser observado em uma ou ambas as patas dianteiras (por exemplo, lamber, enquanto sentado), poucos segundos antes hind-patas. No entanto, patas dianteiras-lamber é um componente normal do comportamento de limpeza. Assim, apenas traseiras-pata reacções são avaliados. Em ocasiões camundongos pode limpar suas patas traseiros também. No entanto, a preparação normal de fazer not duram mais que alguns segundos, não envolve intensivo lambendo e geralmente termina após a limpeza das suas garras.
5. Remover suavemente o animal a partir da placa e colocá-lo na sua gaiola respectiva. A medição do limiar de calor é então repetido para o controle de outras (normal) de animais.
   Nota: TNTs pode ser determinada de um único animal com intervalos de 1-2 minutos, sem retirar o animal a partir da câmara de observação. Determinações da TNT em ratos ou camundongos pode ser repetido várias vezes durante vários dias. Isto é particularmente útil para determinar a TNT média de um animal individual, bem como a sua variação com a idade.
6. A TNT de animais de controlo é expressa como a média de três ou mais limiares ± SEM.
7. A análise estatística dos dados obtidos é realizada para comparar diferentes grupos de tratamento de camundongos ou ratos. Procedimentos paramétricos, incluindo análise de variância pode ser adequadamente utilizado, onde os dados são normalmente distribuídos e onde os grupos de tratamento são homoskedastic, quando estas condições forem satisfeitas as seguintes abordagens podem ser aplicadas. Análise de variância, seguida pelo teste de Newman-Keuls para detectar diferenças em múltiplas medições ie, repetidos TNTs individuais com / sem tratamento ou em pontos de tempo diferentes (por exemplo, os dados da Figura 3). O t de Student-teste pode ser utilizado para comparar dois grupos de dados ou seja, TNTs antes x após o tratamento de droga; o teste t não emparelhado pode ser utilizado para determinar diferenças de mudanças de TNT em droga-tratados vs animais tratados com veículo (por exemplo , os dados da Figura 4).

3. Testando animais diabéticos

A estreptozotocina rato diabético (STZ)-induzido é o modelo animal mais frequentemente utilizada para estudar os mecanismos de PDN e para avaliar drogas analgésicas e terapias ^11,12. Ratos tornados diabéticos por uma dose única intraperitoneal de STZ (60 mg / kg) pode be testados para a hiperalgesia térmica durante a semana ^estr 3 após o início da diabetes ^11. É importante notar que nem todos os ratos diabéticos desenvolver PDN. No entanto, os animais que se desenvolvem hiperalgesia (~ 50%) podem ser facilmente identificados. Com efeito, os seus TNTs são inferiores * normal.

* Para determinar TNTs de STZ-diabéticos ratos, uma temperatura da placa de partida de 15 ° C em vez de 28 ° C é usada. A razão para estas alterações é que a maioria dos animais diabéticos com PDN se espera que sejam ^2,11 hiperalgésica. Por conseguinte, eles terão inferior normais limiares de calor nocivos (por exemplo, <45 ° C).

1. Um rato diabético é colocado na câmara de observação no topo do aparelho de ensaio. O animal é permitido se adapte à superfície da placa até que o animal mostra um comportamento confortável.
   Nota: Tipicamente, um rato diabético não mostra muito do comportamento normal. Os ratos diabéticos são geralmente hipoativo, letárgico, muitas vezes mostrandomovimentos restritos e grooming lento. É raro observar classificação para a tampa da câmara de observação. Após alguns minutos, os ratos diabéticos podem ficar calmamente em um canto da câmara com ocasional sniffing dos arredores.
2. Uma vez que o animal diabético é confortável na câmara de observação, a placa é aquecida até como no Passo 2,3 a rato diabético podem apresentar um comportamento nocifensive envolvendo quer traseira / tona-pata. Isto acontece geralmente a temperaturas não-tóxicas de placa (por exemplo, <45 ° C), ou depois de não mais de 5 minutos na câmara com o aumento da temperatura de 6 ° C / min.
   Nota: A resposta nocifensive de um rato diabético jovem adulto não difere da de um rato normal. No entanto, a temperatura mais baixa evocar tal comportamento é significativamente reduzido.
3. Consulte a Etapa 2,4
4. A média de mais de três limiares no dia da experiência expressa como ° C ± SEM é considerado o limite de calor nocivo do diabetic animais.
   Nota: Um paradigma semelhante ao explicado para ratos normais ou diabéticos pode ser seguido para determinar o efeito anti-nocifensive térmica de analgésicos em limiares de calor.

4. Teste de Analgesia

As propriedades anti-nociceptivos de drogas (por exemplo, analgésicos), bem como a determinação dos parâmetros de farmacológicas tais como a dose mínima eficaz pode ser facilmente obtido usando os passos explicados acima. Prevê-se que doses apropriadas de um analgésico administrado a ratos / camundongos iria aumentar significativamente seus TNTs. Isto é particularmente sensível em animais com hiperalgesia térmica ^3. No entanto, para evitar distorções na interpretação dos resultados, os investigadores envolvidos na observação comportamental de um grupo de animais não deve saber ou estar ciente se os animais foram tratados ou não. Além disso, a droga a ser injectado pelo observador pode ser preparado por outro investigador e rotuladosA, B, C, etc Dosagem é fornecido em uma impressão, que enumera as doses individuais por animal identificado.

Dependendo da droga a ser testada, diferentes doses de um analgésico potencial podem ser administrados a animais normais ou diabéticos 5-15 min antes de testes comportamentais. Controlos adequados devem ser incluídos (isto é, da mesma idade animais injectados apenas com veículo e / ou ratos diabéticos sem PDN) e testados utilizando condições idênticas (por exemplo, à mesma temperatura de partida da placa). Os efeitos crónicos de drogas podem ser testados.

5. Os resultados representativos

A temperatura mais baixa placa evocar reacções nocifensive em qualquer pata posterior de jovens adultos normais não tratados ratos ou ratinhos foram determinados passos seguintes 2-1 a 2-6. Como mostrado na Figura 1, a TNT de ratos adultos jovens normais e ratinhos eram de 47,2 ± 0,2 ° C e 47,5 ± 0,5 ° C, respectivamente.

Temos obsevariação não significativa rved diária de TNTs individuais (Figura 2A) nem alterações significativas de TNTs entre indivíduos da mesma idade (Figura 2B). Diferenças devidas a TNT género não foram observados (não mostrado).

TNTs de adultos jovens STZ-diabéticos ratos foram determinados de uma forma similar como para ratos normais (Passos 3.1 a 3.3). No entanto, a temperatura da placa de partida foi ajustado para 15 ° C em vez de 28 ° C. O comportamento nocifensive de STZ-diabéticos ratos foi avaliada pelo menos três vezes em um indivíduo e de uma forma diária de partida 11 dias após a injecção STZ. Como mostrado na Figura 3, uma queda significativa (p <0,01) no TNT de STZ-diabéticos ratos torna-se evidente duas semanas após a injecção STZ. A média de TNT STZ-diabéticos ratos foi 45,6 ± 0,1 ° C (n = 16, os valores obtidos a partir de 14-23 dias).

Os ratos diabéticos que exibem TNT significativamente menor do que a Normal foram considerados como tendo PDN. Estes ratos foram usados ​​para testar os efeitos agudos anti-nociceptivos propriedades de um analgésico (composto A). TNTs foram determinados em ratos normais e diabéticos injectados quer com uma única dose do composto ou veículo sozinho cinco minutos antes do ensaio. Como mostrado na Figura 4, uma dose intra-peritoneal única do composto aumentou significativamente TNTs de ratos diabéticos quando comparado com os ratos tratados com veículo isolado (45,6 ° C vs 47,6 ° C, respectivamente). O efeito anti-nocifensive do composto A foi também observada em ratos normais, embora significativa (p <0,01), foi menos pronunciado (47,4 ° C vs 48,0 ° C, respectivamente).

Figura 1. Determinação da TNTs de ratos adultos jovens normais ou ratinhos: Os TNTs de ratos adultos jovens (p21-24) ou ratinhos (p20-21) foram testados no iHPAM seguindo as etapas descritas above. Um total de 12 ratos e 25 ratinhos foram testados. As medições foram realizadas durante vários dias e os resultados foram reunidas. Os resultados são expressos como média ± EPM. Os valores mínimo e máximo de TNT registada nestes ratos foram 46,2 ° C e 48,6 ° C respectivamente. No caso de ratinhos, os valores máximo e mínimo de TNT registados foram 48,8 ° C e 44,9 ° C, respectivamente.

Figura 2. Idade-dependência de TNTs em ratos e ratinhos: Um Plotada) são os TNTs de quatro ratos normais (n = 4) de 21 dias de idade determinado pelo menos três vezes ao dia durante 5 dias B) TNTs de ratinhos littermates determinada de uma vez em indicado. idades. Os números no topo de cada ponto de determinação representa o número de ninhada utilizados.

Figura 3. Os ratos diabéticos ficam 3 hiperalgesia nósEKS após o início da diabetes: TNTs de seis (n = 6) com a mesma idade jovem adulto STZ-diabéticos ratos foram determinados a cada dia de partida de 11 dias pós-indução de diabetes. São mostrados médias diárias TNT (média ± SEM). TNTs diabéticos fixados entre 11-13 dias após a injecção-STZ estavam dentro da faixa normal (linha vermelha). Duas semanas após a injeção de STZ TNTs diminuiu significativamente para 45,1 ± 0,4 ° C, (p <0,05).

Figura 4. Agudas anti-nocifensive efeitos do composto B em ratos diabéticos STZ-. Jovens adultos ratos normais (azul grupo n = 12) e idade foram ratos STZ-diabéticos hiperalgésica (verde grupo n = 6) foram testados no iHPAM após a injecção intraperitoneal de veículo (barras escuras) ou composto A. (barras claras) A média ± SEM TNT para cada tratamento (controlo de veículo ou o composto A-tratado) são mostrados. Os asteriscos indicam diferenças estatísticas(P <0,05).

Discussão

Da mesma forma que no teste da placa quente clássico para quantificar hiperalgesia térmica ^4,13, o teste de nocicepção descrito aqui permite uma forma rápida e confiável para quantificar o comportamento nocifensive em ratos e camundongos. No entanto, ao contrário do teste clássico, o método de placa quente incremental é não-invasiva e praticamente livre de estresse. Embora alguns conter é necessário para realizar o teste (ie, o animal deve estar na câmara de observação), ratazanas ou ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Companhia	Número de catálogo
Incremental Hot-Plate Analgesia Medidor	IITC Inc. Life Science	Part # PE34
Série macio 8	IITC Inc. Life Science	Part # Series8
Estreptozotocina	Calbiochem	572201