Détermination rapide du seuil thermique nociceptive chez les rats diabétiques

Résumé

Ici, nous décrivons une procédure rapide simple et fiable pour déterminer la température minimale à laquelle des rats ou des souris montrent un comportement nocifensive, C.-à- L' Seuil thermique nociceptive (TNT). Cette méthode s'applique un stimulus augmente lentement thermique permettant une estimation précise et reproductible de TNTs avec un minimum, le cas échéant, le stress des animaux.

Résumé

Une neuropathie diabétique douloureuse (PDN) est caractérisé par l'hyperalgésie dire, une sensibilité accrue à un stimulus nocif, et l'allodynie dire, l'hypersensibilité aux stimuli normalement inoffensifs ^1. Hyperalgésie et l'allodynie ont été étudiés dans de nombreux modèles de rongeurs de diabète sucré ^2. Toutefois, comme indiqué par Bölcskei et al, la détermination de la «douleur» dans des modèles animaux est difficile en raison de sa nature subjective ^3. En outre, les méthodes traditionnelles utilisées pour déterminer les réponses comportementales à des stimuli thermiques nocifs n'ont généralement pas la reproductibilité et ³ de sensibilité pharmacologique. Par exemple, en utilisant la méthode de la plaque chaude de Ankier ^4, bronche, le retrait et / ou de lécher soit postérieur et / ou pattes de devant est quantifiée comme latences des réflexes à des stimuli thermiques élevés constants (52-55 ° C). Toutefois, les animaux qui sont hyperalgésique à un stimulus thermique, ne pas reproductible montrent des différences dans rélatences Flex à l'aide de ces températures supra-seuil ^{de 3,5.} Comme la méthode récemment décrite de Bölcskei et al. ^6, les procédures décrites ici permet la détermination rapide, sensible et reproductible des seuils nociceptifs thermiques (TNTs) chez les souris et les rats. Procédé utilise augmente lentement stimulus thermique appliquée essentiellement sur la peau de rat / souris surface plantaire. La méthode est particulièrement sensible pour étudier anti-nociception pendant les états hyperalgiques comme PDN. Les procédures décrites ci-dessous sont basés sur ceux publiés en détail par Almasi et al ⁵ et Bölcskei et al ^3. Les procédures décrites ici ont été approuvés le soin des animaux de laboratoire et le Comité d'utilisation (LACUC), Wright State University.

Protocole

TNTs de souris et les rats sont déterminés en utilisant le différentiel de la plaque chaude analgésie mètre [iHPAM, IITC Life Science Inc (Woodland Hills, CA)]. L'équipement se compose de plusieurs composantes: une plaque d'aluminium (10 x 20 cm) avec le système de chauffage en dessous et une chambre d'observation en plexiglas au-dessus, une unité de contrôle de la chaleur, le logiciel d'acquisition de données (série Partie IITC # souple 8), un PC (personal ordinateur) et une pédale pour le démarrage à distance, arrêter ou réinitialiser le contrôle de l'unité. Le système de chauffage permet également de démarrage / arrêt / remise à zéro de l'opération de chauffage manuellement par le biais d'un clavier en face de l'équipement. Le iHPAM peut être réglé pour des vitesses de chauffage différentes, veille / coupure températures.

1. Equipement Set-up

1. Avant animaux d'essai, inspecter visuellement l'unité afin de corroborer les taux de chauffage choisi (par exemple, 6 ° C / min), les premiers secours températures et Final Cut-off (par exemple, 28 ° C et 55 ° C, respectivement).
2. Vérifiez toutes les connexions. Pour conserver une copie électronique des résultats, l'appareil doit être connecté à un ordinateur exécutant la série 8 du logiciel. Alternativement, des copies papier des résultats peuvent être imprimés via le port série de l'unité.
3. Testez le matériel. Appuyez sur la pédale une fois pour s'assurer que le Logiciel de la Série 8 enregistre les données initiales: en veille, les températures de coupure final et le temps en secondes, nécessaire pour atteindre la température de coupure.
4. Comme un test de contrôle en outre, les enquêteurs impliqués dans les expériences peuvent avoir besoin de faire l'expérience du dispositif sur eux-mêmes. Le retrait de la main de la plaque de métal au moment de la perception de la douleur (46-48 ° C) ne doit ni nuire à la peau, ni de produire un malaise plus tard.
5. Une fois que l'unité a été définie et les résultats des étapes 1.3 et 1.4 enregistrées, elles peuvent être comparées. Ceci est utile pour détecter les problèmes potentiels qui pourraient invalider l'utilisation de l'appareil. Par exemple, les écarts entre la formation initiale veille / Final Cut-off Temperatures et de la lecture effective de l'unité, et / ou différences entre les températures affichées par l'unité et la température réelle de la plaque requise pour le retrait de la main.

2. Test animaux normaux

Soit, jeune ou adulte chez le rat Wistar [post-natal (p) l'âge 21-25 jours], ou souris (p21-25) de n'importe quel fond génétique ou le sexe peut être utilisé. Les souris utilisées dans nos expériences sont de la souche C57BL/6J.

1. La nuit avant que les expériences à réaliser, acclimater les animaux en plaçant leurs cages sur le banc où l'iHPAM est placé. Deux heures avant d'effectuer les essais, tournez sur la iHPAM de familiariser les animaux avec le bruit de fond de l'appareil. À ce stade, le iHPAM peut être mis en place et testé afin de vérifier le bon fonctionnement (voir les étapes 1). L'alimentation et l'eau est fournie ad libitum durant tout l'essai, sauf si l'animal est dans la chambre d'observation (voir l'étape 2.1).
   Remarque: Il est important de ne pas présumer que les conditions de laboratoire à des expériences comportementales sont contrôlées par défaut. Une attention particulière devrait être accordée à des facteurs génétiques et environnementaux qui peuvent influencer le résultat des études comportementales (revue dans ^7).
2. Placez délicatement une souris normale / rat dans la chambre d'observation en plexiglass sur le dessus de la plaque chauffante de l'appareil. Permettre aux animaux de s'acclimater à la surface chauffée (fixée à 28 ° C) jusqu'à ce que l'animal présente un comportement confortable.
   Remarque: En vertu de ces conditions chez des rats adultes normaux montrent un comportement exploratoire initiale, à l'occasion debout vers le couvercle de la chambre d'observation tout en reniflant. Après quelques minutes, les rats peuvent montrer des épisodes occasionnels de toilettage et un comportement détendu. Parfois, les rats coucha avec une posture détendue (extension sujets), tandis que par hasard reniflant les environs. Les souris normales sont généralement plus actifs que les rats. Cependant, les souris présentent un comportement exploratoire détendue après quelques minutes in la chambre d'observation. Il est exceptionnellement rare d'observer des comportements soit Évasion (par exemple, en sautant, en essayant de s'échapper de la chambre d'observation) ou des attitudes défensives (par exemple, crissement). Il est également important de noter que les souris peuvent transmettre la douleur d'une souris à un autre ^8. Par conséquent, il peut être important de souris de l'essai placés dans des cages séparées.
3. Lieu dans le miroir arrière de la chambre d'observation, afin de permettre à tous les angles des observations. Un trépied la tenue d'une caméra vidéo numérique peut être d'une aide pour déterminer le moment exact où nocifensive (éviter la douleur) le comportement a eu lieu.
4. Une fois que l'animal est à l'aise dans la chaleur de chambre d'observation de la plaque en appuyant sur la pédale. Lorsque la température de la plaque se réchauffe à un rythme de 6 ° C / minute, les animaux normaux présentent un comportement nocifensive impliquant soit la patte arrière-* habituellement des températures qui font rage de 46 à 48 ° C ^3,5,9,10. Ainsi, l'animal est typique sous forme retiré le observableschambre ation après environ 3 minutes.
   Remarque: L'observation de la réponse typique d'un nocifensive c.-à-rat ou la souris, biche-patte à lécher, tout en agitant et / ou de levage, est suffisant pour résilier le stimulus thermique. Ce résultat est obtenu en appuyant sur la pédale. En ce moment, le logiciel enregistre la température de la plaque et la plaque se refroidit immédiatement jusqu'à ce que la température de veille (28 ° C) est atteint (~ 0,5 min). Ce savoir la température, celle qui évoque une réaction nocifensive est considérée comme le seuil de la chaleur nocive (TNT) de la normale (contrôle) des animaux.
   * Parfois, en particulier chez la souris, le comportement à la température nocifensive nocif peut d'abord être observée dans un ou deux pattes de devant (par exemple, lécher tout en restant assis), les quelques secondes avant pattes arrière. Toutefois, avant-patte à lécher est un composant normal du comportement de toilettage. Ainsi, seuls les arrières-patte réactions sont évaluées. Dans reprises souris peut toiletter leurs pattes postérieures ainsi. Toutefois, le toilettage normal, ne not durent plus de quelques secondes, n'implique pas intensive lécher et se termine généralement après le nettoyage de ses griffes.
5. Retirez délicatement l'animal de la plaque et placez-le dans sa cage respective. La mesure du seuil de chaleur est ensuite répété pour un autre contrôle (normal) des animaux.
   Note: TNTs peut être déterminée dans un seul animal à des intervalles de 1-2 minutes sans retirer l'animal de la chambre d'observation. Déterminations TNT chez le rat ou la souris peut être répété plusieurs fois pendant plusieurs jours. Ceci est particulièrement utile pour déterminer la moyenne TNT d'un animal individuel ainsi que sa variation avec l'âge.
6. La TNT sur les animaux de contrôle est exprimé comme la moyenne des trois ou plusieurs seuils ± SEM.
7. L'analyse statistique des données obtenues est réalisée afin de comparer différents groupes de traitement de souris ou des rats. Procédures paramétriques, y compris l'analyse de la variance peut être utilisé de façon appropriée lorsque les données sont normalement distribuées et où les groupes de traitement sont des homoskedastic; lorsque ces conditions ont été remplies les approches suivantes peuvent être appliquées. L'analyse de variance suivie par le test de Newman-Keuls pour détecter des différences dans de multiples mesures, répétées à savoir TNTs individuels avec / sans traitement ou à des moments différents (par exemple, les données de la figure 3). Le t de Student apparié-test peut être utilisé pour comparer deux groupes de données à savoir les TNTs avant vs après traitement de la toxicomanie, le test t non apparié peut être utilisée pour déterminer les différences dans les changements TNT dans la drogue traitées vs véhicule chez les animaux traités (par exemple , des données dans la figure 4).

3. Test des animaux diabétiques

Le rat diabétique par streptozotocine (STZ) induite par le modèle animal le plus couramment utilisé pour étudier les mécanismes de PDN et pour évaluer les médicaments et les thérapies analgésiques ^11,12. Les rats rendus diabétiques par une dose unique intrapéritonéale de STZ (60 mg / kg) peut be test de dépistage du hyperalgésie thermique au cours de la 3 ^ème semaine après l'apparition du diabète ^11. Il est important de noter que tous les rats diabétiques développent PDN. Toutefois, les animaux qui ne développent une hyperalgésie (~ 50%) peuvent être facilement identifiés. En effet, leurs TNTs sont inférieurs à la normale *.

* Pour déterminer TNTs de STZ-rats diabétiques, une température de la plaque de départ de 15 ° C au lieu de 28 ° C est utilisée. La raison de ces changements est que la plupart des animaux diabétiques avec PDN devraient être ^2,11 hyperalgésique. Par conséquent, ils sont inférieurs à la normale seuils de chaleur nocives (par exemple, <45 ° C).

1. Un rat diabétique est placé dans la chambre d'observation sur le dessus de l'appareil de test. L'animal est autorisé à s'acclimater à la surface de la plaque jusqu'à ce que l'animal présente un comportement confortable.
   Remarque: En règle générale, un rat diabétique ne montre pas beaucoup du comportement normal. Les rats diabétiques sont généralement hypoactif, léthargique; montrant souventmouvements restreints et toilettage lente. Il est rare d'observer le classement vers le couvercle de la chambre d'observation. Après quelques minutes, les rats diabétiques peuvent tranquillement rester dans un coin de la chambre avec occasionnel reniflant de l'environnement.
2. Une fois l'animal diabétique est à l'aise dans la chambre d'observation, la plaque est chauffée jusqu'à comme à l'étape 2.3, le rat diabétique peut présenter un comportement nocifensive impliquant soit derrière / avant-patte. Cela se produit généralement à des températures de la plaque non-nocives (par exemple, <45 ° C), ou au plus tard après 5 minutes dans la chambre avec l'augmentation de température 6 ° C / min.
   Remarque: La réponse nocifensive d'un rat diabétique jeune adulte ne diffère pas de celle d'un rat normal. Toutefois, la température la plus basse évoquant un tel comportement est considérablement réduit.
3. Voir étape 2.4
4. La moyenne de plus de trois seuils dans le jour de l'expérience exprimée en ° C ± SEM est considéré comme le seuil de la chaleur nocive de l'diabetianimaux c.
   Remarque: Un paradigme similaire à celle expliquée pour les rats normaux ou diabétiques peuvent être suivies pour déterminer la thermique anti-nocifensive effet des analgésiques sur les seuils de chaleur.

4. Test analgésie

Les propriétés anti-nociceptifs de médicaments (par exemple, analgésiques), ainsi que la détermination des paramètres pharmacologiques tels que la dose minimale efficace peut être obtenu facilement en utilisant les étapes expliquées ci-dessus. Il est prévu que les doses adéquates d'un analgésique administré à des rats et les souris pourrait accroître considérablement leurs TNTs. Ceci est particulièrement sensible chez les animaux atteints thermique hyperalgésie ^3. Toutefois, pour éviter les biais dans l'interprétation des résultats, les chercheurs impliqués dans l'observation du comportement d'un groupe d'animaux ne doit pas savoir ou être conscient que si les animaux avaient été traités ou non. En outre, les médicaments doivent être injectés par l'observateur peut être préparé par un autre enquêteur et étiquetésA, B, C, etc Posologie est fourni dans un imprimé, énumérant les doses individuelles par animal identifié.

Selon le médicament à l'essai, des doses différentes d'un analgésique potentiel peut être administré à des animaux normaux ou diabétiques 5-15 min avant des tests de comportement. Des contrôles appropriés doivent être inclus (c.-à-appariés selon l'âge des animaux injectés avec le véhicule seul et / ou les rats diabétiques sans PDN) et testés en utilisant des conditions identiques (par exemple, même température de départ de la plaque). Les effets chroniques de médicaments peuvent être testés ainsi.

5. Les résultats représentatifs

La température la plus basse plaque évoquant des réactions nocifensive soit patte arrière de jeunes adultes normaux non traités rats ou les souris ont été déterminés comme suit 2-1 à 2-6. Comme le montre la figure 1, TNT normales chez des rats adultes jeunes et les souris étaient de 47,2 ± 0,2 ° C et 47,5 ± 0,5 ° C, respectivement.

Nous avons observed ni de variation significative quotidienne de TNTs individuelles (figure 2A), ni des changements importants de TNTs entre les individus du même âge (figure 2B). Différences TNT raison de leur sexe n'ont pas été observées (non représentée).

TNTs de jeunes adultes STZ-diabétiques des rats ont été déterminés d'une manière similaire à celle de rats normaux (étapes 3.1 à 3.3). Toutefois, la température de la plaque de départ a été fixé à 15 ° C au lieu de 28 ° C. Le comportement nocifensive de STZ-rats diabétiques a été évalué au moins trois fois chez un individu et d'une façon quotidienne à partir onze jours post-injection de STZ. Comme le montre la figure 3, une baisse significative (p <0,01) dans la TNT de STZ-diabétiques rats devient évident deux semaines après l'injection de STZ. La moyenne TNT de STZ-rats diabétiques était de 45,6 ± 0,1 ° C (n = 16, les valeurs mises en commun de quelques jours 14-23).

Les rats diabétiques présentant significativement plus faible que Norma TNTl ont été considérées comme PDN. Ces rats ont été utilisés pour tester les aigus anti-nociceptifs propriétés d'un analgésique (composé A). TNTs ont été déterminées chez des rats normaux et diabétiques injectés avec une dose unique du composé ou du véhicule seul cinq minutes avant le test. Comme le montre la figure 4, une seule voie intra-péritonéale dose du composé augmenté de façon significative TNTs des rats diabétiques lorsque comparés à des rats traités avec le véhicule seul (45,6 ° C contre 47,6 ° C, respectivement). L'effet anti-nocifensive du composé A a également été observée chez des rats normaux, bien que significative (p <0,01), il a été moins prononcée (47,4 ° C contre 48,0 ° C, respectivement).

Figure 1. Détermination de la TNTs de jeunes rats adultes normaux ou souris: Les TNTs de jeunes rats adultes (p21-24) ou la souris (p20-21) ont été testés dans le iHPAM suivant les étapes décrites above. Un total de 12 rats et les souris 25 ont été testés. Mesures ont été effectuées pendant plusieurs jours et les résultats ont été regroupés. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. La valeurs minimales et maximales enregistrées dans ces TNT rats étaient 46,2 ° C et 48,6 ° C respectivement. Dans le cas des souris, les valeurs maximales et minimales enregistrées TNT étaient à 48,8 ° C et 44,9 ° C, respectivement.

Figure 2. Âge-dépendance de TNTs chez les rats et les souris: Un Plotted) sont les TNTs de quatre rats normaux (n = 4) de 21 jours d'âge déterminées au moins trois fois par jour pendant 5 jours B) TNTs de souris compagnons de portée déterminée une fois à indiqué. les âges. Les numéros sur le dessus de chaque point de détermination représente le nombre de littermates utilisés.

Figure 3. Les rats diabétiques deviennent 3 hyperalgésique nouseks après l'apparition du diabète: TNTs de six (n = 6) ans assortis jeunes adultes STZ-diabétiques rats ont été déterminés tous les jours à partir 11 jours après l'induction du diabète. Montré sont quotidiennes moyennes TNT (moyenne ± SEM). TNTs diabétiques fixées entre 11-13 jours post-injection de STZ situaient dans la fourchette normale (ligne rouge). Deux semaines après injection de STZ TNTs diminué de façon significative à 45,1 ± 0,4 ° C, (p <0,05).

Figure 4. Aigus anti-nocifensive effets de composé B à la STZ-rats diabétiques. Jeunes adultes rats normaux (bleu groupe n = 12) et appariés pour l'âge des rats STZ-diabétiques hyperalgiques (groupe vert n = 6) ont été testés dans le iHPAM après une injection intrapéritonéale de véhicule (barres noires) ou composé A. (barres claires) La moyenne ± SEM TNT pour chaque traitement (contrôle du véhicule ou d'un composé A-traité) sont présentés. Les astérisques indiquent les différences statistiques(P <0,05).

Discussion

De même à l'épreuve plaque chauffante classique à quantifier thermique hyperalgésie ^4,13, le dosage de la nociception décrit ici permet d'une manière rapide et fiable pour quantifier le comportement nocifensive chez les rats et les souris. Toutefois, contrairement au test classique, le différentiel de la plaque chaude méthode est non invasive et pratiquement sans stress. Bien que certains retenir est nécessaire pour effectuer le test (c.-à-, l'animal doit être dans la chambre ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue
Incrémental à chaud Plate analgésie compteur	IITC Life Science Inc	N ° de pièce PE34
Série souple 8	IITC Life Science Inc	N ° de pièce Series8
Streptozotocine	Calbiochem	572201