당뇨병 쥐의 열전달 Nociceptive 본부 신속한 결정

요약

여기서는, 쥐가이나 쥐가 nocifensive 동작 표시되는 최저 온도를 결정하는 빠른 안정적이고 간단한 절차를 설명 즉 열 nociceptive 임계값 (TNT). 어떤 경우에이 방법은 동물, 스트레스를 최소로 TNTs의 정확하고 재현성 평가있게 천천히 증가 열 자극을 적용합니다.

초록

고통스런 당뇨병의 신경 장해 (PDN)는 hyperalgesia 즉, 유해 자극에 대한 민감성 증가, 그리고 allodynia 즉, 일반적으로 무해한 자극에 ^{1 ~} 과민성이 특징입니다. Hyperalgesia와 allodynia은 당뇨병 ^2의 다양한 설치류 모델에서 공부했습니다. 그러나, 같은 Bölcskei 외, 동물 모델에서 "고통"의 결정에 의해 명시하는 것은 그것의 주관적 성격 ^{3 ~} 인해 도전한다. 또한, 유해 열 자극에 대한 행동 반응을 결정하는 데 사용되는 전통적인 방법은 일반적으로 재현성과 pharmacological 감도 ³ 부족합니다. 예를 들어, Ankier ^4의 핫 플레이트 메서드를 사용하여, 움찔, 금단 증상 및 / 또는 두 뒷다리와 / 또는 이물-발냄새 핥아는 일정한 높은 온도 자극 (52-55 ° C)에서 반사 대기 시간으로 계량합니다. 그러나, 열 자극에 hyperalgesic있는 동물 reproducibly 재의 차이를 표시하지 않습니다그 위에 - 임계 온도 ^3,5를 사용하는 플렉스 대기. Bölcskei 외. ⁶ 최근에 설명한 방법으로, 여기에 설명된 절차는 생쥐와 쥐에서 열 nociceptive 임계값의 신속한 민감하고 재현성 결정 (TNTs)에 있습니다. 방법은 마우스 / 쥐 발바닥 표면의 피부에 주로 적용 서서히 증가하고 열 자극을 사용합니다. 방법은 같은 PDN 같은 hyperalgesic 주들 중에 안티 nociception를 공부할 특히 민감합니다. 우는 설명한 절차 Almási 외 ⁵ Bölcskei 외 ³ 자세하게 출판 것들을 기반으로합니다. 절차는 실험실 동물 관리 및 사용위원회 (LACUC), 라이트 주립 대학의 승인되었습니다 여기에 설명했다.

프로토콜

생쥐와 쥐의 TNTs은 사용에 의해 결정되는 증분 핫 플레이트 무통 m [iHPAM, IITC 주식 회사 생명 과학 (우드랜드 힐스, 캘리포니아)]. ; 데이터 수집을위한 열 조절 장치, 소프트웨어 (IITC 파트 # 소프트 시리즈 8), PC (개인용 밑에 난방 시스템 이상 플렉시 글라스 관측 챔버와 알루미늄 판 (10 × 20cm) : 장비는 여러 구성 요소로 구성되어 컴퓨터)와 footswitch 원격 출발, 중지 또는 장치의 제어를 재설정하십시오. 난방 시스템은 또한 시작 / 중지 / 장비 앞에서 키패드를 통해 수동으로 가열 과정의 재설정 가능합니다. iHPAM 다양한 가열 속도, 대기 / 컷오프 온도로 설정할 수 있습니다.

1. 장비 설정

1. 시험 동물 전에 시각적으로 선택한 가열 속도 (예, 6 ° C / 분), 초기 대기 및 컷 - 오프 최종 온도 (예, 28 ° C와 55 ° C, 각각) 거였는데 장치를 검사한다.
2. 모든 연결을 확인합니다. 결과의 전자 복사본을 유지하려면, 장치는 소프트웨어 시리즈 8을 실행중인 컴퓨터에 연결되어 있어야합니다. 또는 결과의 하드 카피는 기기의 시리얼 포트를 통해 밖으로 인쇄할 수 있습니다.
3. 장비를 테스트합니다. 초기 대기, 최종 컷오프 온도 컷 - 오프 온도에 도달하는 데 필요한 초 단위 시간 : 소프트웨어 시리즈 8 기록 데이터를 확인하기 위해 한번 footswitch을 누르십시오.
4. 추가 제어 테스트로 실험에 참여 조사관은 자신에 장치를 체험 할 수 있습니다. 통증 지각의 순간 (46-48 ℃)에서 금속 접시에서 손을 철수하는 것은 둘 다 피부에 악영향을하지 않으며 나중에 불편을 생산해야합니다.
5. 장치가 설정하고 단계 1.3과 1.4의 결과가 기록되면 그들은 비교할 수 있습니다. 이것은 장치의 사용을 무효화 수있는 잠재적인 문제를 감지하는 도움이됩니다. 예를 들어, 초기 최종 / 대기 컷 - 오프 템피 간의 불일치ratures와 실제 단위의 읽기 및 / 또는 장치와 핸드 탈퇴에 필요한 실제 플레이트 온도에 의해 표시되는 온도 사이의 차이.

2. 정상 동물 테스트

어느 젊은이나 어른 Wistar 쥐 [포스트 산후 (P) 연령은 21-25일] 또는 다른 유전적 배경이나 성별의 생쥐 (p21-25)을 사용할 수 있습니다. 실험에 사용된 생쥐가 변형 C57BL/6J 라구요.

1. 실험이 수행되어야 밤 전에 iHPAM가 게재된 벤치에 자신의 새장을 배치하여 동물을 적응. 테스트를 수행하기 전에 두 시간은 기기의 잡음과 함께 동물에 익숙해 iHPAM 켜십시오. 이 시점에서 iHPAM가 설정하고 (단계 1 참조) 적절한 기능을 확인하는 테스트를 할 수 있습니다. 음식과 물이 동물 (단계 2.1를 참조) 관측 챔버에있는 경우를 제외하고, 시험 전반에 걸쳐 광고 libitum를 제공합니다.
   참고 :이 꼬마 도깨비입니다행동 실험에서 실험 조건은 기본적으로 제어되는 것으로 가정하지 않도록 ortant. 특별한주의는 행동 연구 ⁽⁷ 검토)의 결과에 영향을 줄 수 유전 및 환경 요인에 지불되어야합니다.
2. 부드럽게 기기의 가열판 위에 플렉시 글라스 관측 실에서 일반 마우스 / 쥐를 놓습니다. 동물이 편안하게 동작을 보여줍 때까지 동물이 따뜻하게 표면 (° C ~ 28에서 설정)에 적응하도록 허용합니다.
   참고 :이 조건에서 정상 성인 쥐 냄새 동안 때때로 관찰 챔버의 뚜껑을 향해 서서, 초기 탐험 동작을 보여줍니다. 몇 분 후에 쥐가 정리의 캐주얼 관찰하고 편안한 동작을 보여줄 수 있습니다. 부담없이 주변을 킁킁하면서 때로는 쥐가 편안한 몸의 자세 (자주 발생하는 확장자)와 동침. 일반 마우스는 보통 쥐보다 더 활성 상태입니다. 그러나, 마우스는 제가 몇 분 후 편안한 답사의 행동을 보여관측 실 그렇죠. 그것도 (예, 점프, 전망대 챔버로부터 벗어나려고 노력) 이스케이프 동작이나 방어적인 태도를 (예, 비명을 지르며 죽어) 관찰하는 매우 드문 경우입니다. 생쥐 한 마우스에서 다른 ⁸ 고통을 통신할 수 없습니다하는 것도 중요합니다. 따라서 별도의 새장에 배치 테스트 마우스에 중요있을 수 있습니다.
3. 장소는 모든 각도에서 관찰을 허용하기 위해 관찰 챔버의 뒷면에 반사. 디지털 비디오 카메라를 들고 삼각대는 nocifensive (고통이 피할 수) 문제가 발생했던되는 정확한 순간을 결​​정하는 데 도움이 될 수 있습니다.
4. 일단 동물 footswitch을 눌러 접시까지 관측 챔버 더위에 편안한입니다. 플레이트 온도가 6 ° C / 분의 속도로 가열하면, 정상적인 동물 중 뒷다리-앞발을 포함한 nocifensive 동작 46에서 48 ° C에서 ^3,5,9,10에 성난 * 일반적으로 온도. 따라서 동물 observ 전형 제거한 형태입니다약 3 분 후에 ation 챔버.
   참고 : 떨고 및 / 또는 리프팅하면서 쥐의 드나 마우스 IE의 전형 nocifensive 반응을 관찰, 뒷다리 - 앞발로 땅을 차다, 핥아, 열 자극을 종료할 수있을만큼이다. 이것은 footswitch을 눌러 이루어진다. 이때 소프트웨어는 접시의 온도를 기록하고 번호판은 즉시 대기 온도 (28 ° C)까지 내려 냉각 (~ 0.5 분)에 도달한다. 이 온도 즉, 어떤 nocifensive 반응과 끝, 하나는 정상적인 (제어) 동물의 유해 열 임계값 (TNT)로 간주된다.
   * 가끔은, 특히 마우스에 유해 온도 nocifensive 문제는 첫 번째에서 관찰 또는 두 forepaws (예, 앉아있는 동안 핥아), 몇 초 뒷다리-발냄새 전에 수 있습니다. 그러나 이물-다쳤구나 핥아도 돌보는 행동의 정상적인 구성 요소입니다. 그러므로 오직 뒷다리 - 발자국 반응이 평가됩니다. 행사의 생쥐뿐 그들의 뒷다리 - 발 넣기 수 있습니다. 그러나, 정상적인 정리는 n을 할몇 초보다는 마지막으로 더 많은 양도, 핥아 집중 포함되지 않고 보통의 발톱 청소 후에 끝납니다.
5. 부드럽게 접시에서 동물을 제거하고 각각의 케이지에 넣습니다. 열 임계값 측정 그런 다음 다른 컨트롤 (일반) 동물에 대해 반복됩니다.
   참고 : TNTs는 관측 챔버에서 동물을 제거하지 않고 1-2분의 간격으로 하나의 동물에서 확인할 수 있습니다. 쥐 또는 생쥐에서 TNT의 결정은 몇 일 동안 여러 번 반복 수 있습니다. 이것은 평균 각 동물의 TNT뿐만 아니라 나이와 그 변화를 결정하는 데 특히 유용합니다.
6. 컨트롤 동물 TNT는 세 개 이상의 임계값 ± SEM의 평균으로 표시됩니다.
7. 획득 데이터의 통계 분석은 생쥐 또는 쥐의 다른 치료 그룹을 비교하기 위해 수행됩니다. 분산 분석을 포함한 파라메 트릭 절차는 적절히 데이터가 정상적으로 배포되는 곳에 사용되며 치료 그룹은 호모가 어딘지 수 있습니다skedastic, 이러한 조건은 다음과 같은 접근 방법을 적용할 수있는 만족되었을 때. 와 / 치료없이 또는 다른 시간 지점 (예, 그림 3의 데이터)에서 개별 TNTs을 반복 여러 측정 즉 차이를 감지 뉴먼-Keuls 시험 뒤에 분산 분석. 이점 학생의 T-테스트는 약물 치료 후 비교하기 전에 두 데이터 그룹 즉, TNTs을 비교하는 데 사용될 수 있으며, T-테스트 unpaired는 (예 : 차량 취급 동물 수와 약물 치료의 TNT 변화의 차이를 결정하는 데 사용할 수 있습니다 , 그림 4의 데이터).

3. 당뇨병 동물 테스트

streptozotocin (STZ) 유발 당뇨병 쥐들은 PDN의 메커니즘을 연구하고 진통 약물과 치료법 ^11,12을 평가하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 동물 모델이다. 쥐은 STZ의 단일 intraperitoneal 복용량 (60 밀리그램 / ㎏) 수 B에 의해 당뇨했다전자는 당뇨병 발병 후 ¹¹ 제 ^{3 주일} 동안 열 hyperalgesia에 대한 검사. 그것은 모든 당뇨병 환자의 쥐가 PDN을 개발 점에 유의하는 것이 중요합니다. 그러나 hyperalgesia를 (~ 50 %) 개발 않는 동물은 쉽게 확인할 수 있습니다. 실제로, 그들의 TNTs 정상 * 이하입니다.

C 대신 28 * STZ-당뇨 쥐의 TNTs을 확인하려면 15 시작 플레이트 온도 ° ° C가 사용됩니다. 이러한 변화의 이유는 PDN와 대부분의 당뇨병 동물 hyperalgesic ^2,11 것으로 예상되고있다. 그러므로, 그들은 정상적인 유해 열 임계값보다 낮은 것이다 (예를 들어, <45 ° C).

1. 당뇨병 쥐들은 테스트 장치 위에 전망대 챔버에 배치됩니다. 동물은 동물이 편안하게 동작을 보여줍 때까지 플레이트 표면에 적응하도록 허용됩니다.
   참고 : 일반적으로 당뇨병 쥐가 정상적인 행동의 정도를 표시하지 않습니다. 당뇨병 쥐들은 기면, 보통 hypoactive이므로 자주 보여주는제한된 움직임과 느린 정리. 그것은 관찰 챔버의 뚜껑으로 순위를 관찰하는 드문 것입니다. 몇 분 후, 당뇨병 쥐들은 침착하게 캐주얼 분위기의 스니핑과 챔버의 일각에 남아 있습니다.
2. 당뇨병 동물 관찰 실에서 편안한되면 당뇨 쥐가 뒷다리 / 앞 - 앞발로 땅을 차다 중 하나를 포함한 nocifensive 동작이 수 단계 2.3에서와 같이 플레이트가 가열된다. 이것은 보통 비 유해 플레이트 온도 (예를 들어, <45 ° C)이나 6 ° C / 분, 온도 상승과 챔버에서 더이상 5 달러 분 후에 발생합니다.
   참고 : 젊은 성인 당뇨 쥐의 nocifensive 응답은 정상 쥐의 차이가되지 않습니다. 그러나 그런 행동을 evoking 최저 기온이 크게 저하됩니다.
3. 단계 2.4 참조
4. 실험 하루 복용량보다 3 임계값의 말은 °로 표현 C ± SEM은 diabeti의 유해 열 임계치로 간주됩니다C 동물.
   참고 : 하나와 유사한 패러다임은 정상이나 당뇨 쥐에 대한 설명은 열 임계값에 대한 진통제의 열 방지 nocifensive 효과를 확인하기 위해 미행 수 있습니다.

4. 테스트 진통제

약물의 안티 nociceptive 속성 (예 : 진통제)뿐 아니라 최소한의 효과적인 복용량과 같은 pharmacologic 매개 변수의 결정은 쉽게 위의 설명한 단계를 사용하여 얻을 수 있습니다. 그것은 쥐 / 생쥐에게 투여 진통제의 적절한 복용은 크게 자신의 TNTs을 높일 것이라고 예측하고 있습니다. 이것은 열 hyperalgesia ³ 동물 특히 민감합니다. 그러나, 결과의 해석에 편견을 피하기 위해, 동물 단체의 행동 관찰에 관련된 수사관 알고 있거나 동물 치료 여부를 받았다면 인식해서는 안됩니다. 또한, 관찰자​​에 의해 주입되는 약물은 다른 수사관에 의해 준비와 라벨 수A, B는 C 등을 투여가 확인된 동물마다 개별 접종을 나열, 인쇄물로 제공됩니다.

테스트중인 약물에 따라 잠재적인 진통제의 다른 복용은 정상이나 당뇨병 동물 5-15 분 전에 동작 테스트를 실시 수 있습니다. 적절한 컨트롤이 포함되어 있습니다 (즉, 차량을 주사 연령 유사한 동물 실행형 및 / 또는 PDN없이 당뇨 쥐)와 (접시의 예 : 동일한 시작하는 온도) 동일한 조건을 사용하여 테스트해야합니다. 약물의 만성 효과는 물론 테스트할 수 있습니다.

5. 대표 결과

젊은 성인 정상이 아닌 취급 쥐 또는 생쥐의 양쪽 뒷다리-한것 땜 nocifensive 반응을 evoking 최저 플레이트 온도는 2-6으로 다음과 같은 단계를 2-1으로 결정됩니다. 그림 1은 정상 젊은 성인 쥐 및 생쥐의 TNT와 같이 있었 47.2 ± 0.2 ° C와 47.5 ± 0.5 ° C, 각각.

우리는 obse가개인의 TNTs (그림 2A)이나 같은 연령의 개인 (그림 2B) 중에서 TNTs의 중요한 변화 rved도 상당한 매일 변화. 성별에 의한 TNT의 차이점은 (보이지 않음) 관찰되지 않았다.

젊은 성인 STZ-당뇨 쥐의 TNTs 정상 쥐 (단계 3.1-3.3)에 관해서는 유사한 방식으로 결정됩니다. 그러나 시작 플레이트의 온도가 15로 설정했습니다 ° C ~ 대신 28 ° C. STZ-당뇨 쥐의 nocifensive 행동은 개인과 십일일 후 STZ 주사를 시작하는 일상 패션에 적어도 세 번 평가되었다. 그림 3, STZ-당뇨 쥐의 TNT에 큰 방울 (P <0.01)에 나타난 것은 분명 이주 후 STZ 분사됩니다. STZ-당뇨의 쥐의 평균 TNT는 45.6이었다 ± 0.1 ° C (N = 16 일 14-23에서 풀링된 값).

노마보다 훨씬 낮은 TNT을 전시 당뇨 쥐나는 PDN가로 간주되었다. 이러한 쥐들은 진통제의 급성 방지 nociceptive 속성 (복합)를 테스트하기 위해 사용되었습니다. TNTs 5 분 검사 전 혼자 화합물이나 차량 중 하나 복용량을 주사 정상과 당뇨 쥐에서 결정됩니다. 차량에 혼자 (45.6 ° C 대 47.6 ° C, 각각)로 치료 쥐에 비해 그림 4와 같이, 화합물의 단일 내부 복막 선량 크게 당뇨 쥐의 TNTs 증가했습니다. 화합물의 안티 nocifensive 효과도 정상 쥐에서 관찰되었다;. 상당 (P <0.01), 그것은 덜 발음 (47.4 ° C 대 48.0 ° C, 각각 이전) 비록

1 그림. 정상 젊은 성인 쥐 또는 생쥐들의 TNTs의 결정 : 젊은 성인 쥐 (p21-24) 또는 마우스 (p20-21)의 TNTs는 단계 ABO 설명한 다음 iHPAM에서 테스트되었습니다같군. 12 쥐 25 생쥐의 총 테스트되었습니다. 측정은 몇 일 동안 수행되었으며 결과는 풀링된되었다. 결과는 말은 ± SEM을로 표현됩니다. 이 쥐에 기록된 최소 및 최대 TNT 값은 46.2 ° C와 48.6 ° C에서 각각 있었다. 생쥐의 경우 기록된 최대 및 최소 TNT 값은 각각 48.8 ° C와 44.9 ° C 있었다.

그림 2. 쥐 및 생쥐의 TNTs의 연령 의존성 :) 꾸몄다는 5 일 동안 적어도 세 번 매일 결정 연령 21 일 사 정상 쥐 (N = 4)의 TNTs입니다 B)를 생쥐의 TNTs는 지적에 한 번 결정 littermates. 나이. 각 결정 포인트의 꼭대기에서 숫자가 사용되는 littermates의 수를 나타냅니다.

그림 3. 당뇨병 쥐들이 hyperalgesic 세 된 우리당뇨병 발병 후 eks 여섯 (N = 6) 연령 일치하는 젊은 성인 STZ-당뇨 쥐의 TNTs은 11일 당뇨병 포스트 유도부터 매일 결정됩니다. 일일 TNT의 평균 (± SEM을 의미) 표시됩니다. 11~13일 후 STZ 분사 사이에 결정 당뇨병 TNTs가 정상 범위 (빨간 선) 내에 있었다. STZ 주입 TNTs는 45.1로 크게 감소 2 주 후에 ± 0.4 ° ​​C, (P <0.05).

4 그림. STZ-당뇨 쥐의 화합물 B의 급성 방지 nocifensive 효과. 젊은 성인 정상 쥐 (파란색 그룹 N = 12)과 연령은 STZ-당뇨 hyperalgesic의 쥐 (녹색 그룹 N = 6)은 차량의 intraperitoneal 주사 후 iHPAM에서 테스트되었습니다 일치 (어두운 바) 또는 화합물 (조명 바). 각 처리 (차량 제어 또는 화합물-대우)에 대한 의미 TNT ± SEM이 표시됩니다. 별표는 통계적 차이를 나타내는(P <0.05).

토론

마찬가지로 열 hyperalgesia ^4,13를 정할 클래식 핫 플레이트 테스트로 nociception의 분석은 여기에서 설명한 쥐 및 생쥐의 nocifensive 행동을 계량하기위한 빠르고 안정적인 방법을 허용합니다. 그러나 고전 검사와는 반대로, 증분 핫 플레이트 방식은 비침습와 거의 스트레스는 무료입니다. 구속 일부가 (즉, 동물 관찰 실에 있어야합니다) 테스트를 수행할 필요가 있지만, 쥐 또는 생쥐가 유...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
이름	회사	카탈로그 번호
증분 핫 플레이트 진통제 측정기	IITC 주식 회사 생명 과학	부품 # PE34
소프트 시리즈 8	IITC 주식 회사 생명 과학	부품 # Series8
Streptozotocin	Calbiochem	572,201