Schnelle Bestimmung der Wärmeleistung und nozizeptiven Grenzwerts bei diabetischen Ratten

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine schnelle zuverlässige und einfache Verfahren, um die niedrigste Temperatur, bei der Ratten oder Mäusen zeigen nozifensiven Verhalten bestimmen, Dh Die Thermische nozizeptive Schwelle (TNT). Diese Methode gilt eine langsam zunehmende thermische Reiz ermöglicht präzise und reproduzierbare Bestimmung von TNTs mit einem Minimum, wenn überhaupt, den Stress der Tiere.

Zusammenfassung

Schmerzhafter diabetischer Neuropathie (PDN) wird von Hyperalgesie, dh, erhöhte Empfindlichkeit gegenüber schädlichen Reiz, und Allodynie dh Überempfindlichkeit gegen normalerweise harmlose Reize ¹ gekennzeichnet. Hyperalgesie und Allodynie wurden in vielen verschiedenen Tiermodellen des Diabetes mellitus ² untersucht worden. Jedoch wird, wie durch Bölcskei et al, Bestimmung der "Schmerz" in Tiermodellen festgestellt Herausforderung aufgrund seiner subjektiven Natur ^3. Darüber hinaus sind die traditionellen Methoden verwendet werden, um Verhaltensreaktionen auf schädliche thermische Reize bestimmen in der Regel fehlt die Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit pharmakologische ^3. Zum Beispiel, indem Sie die Hot-Plate-Verfahren von Ankier ^4, zusammenzucken, ist Rückzug und / oder Lecken der beiden Hinterbeine und / oder Vorderpfoten als Reflex Latenzen bei einer konstanten hohen thermischen Reizen (52-55 ° C) quantifiziert. Jedoch keine Tiere, die Hyperalgesie auf thermische Reize sind nicht reproduzierbar zeigen Unterschiede in der Reflex Latenzen bei der Nutzung dieser supra-Schwelle Temperaturen ^3,5. Wie der kürzlich beschriebenen Methode der Bölcskei et al. ^6, können die hier beschriebenen Verfahren für die schnelle, empfindliche und reproduzierbare Bestimmung der thermischen nozizeptiven Grenzwerte (TNTs) bei Mäusen und Ratten. Das Verfahren verwendet langsam ansteigenden thermischen Stimulus meist auf die Haut der Maus / Ratte plantare Oberfläche aufgebracht. Das Verfahren ist besonders empfindlich gegen Anti-Nozizeption während hyperalgetische Staaten wie PDN zu studieren. Die beschriebenen Verfahren sind unten auf die, die im Detail von Almási et al ⁵ und Bölcskei et al ³ veröffentlicht wurde. Die hier beschriebenen Verfahren genehmigt worden sind die Versuchstierkunde Care und Use Committee (LACUC), Wright State University.

Protokoll

TNTs von Mäusen und Ratten werden durch Verwendung bestimmt das inkrementelle Hot-Plate-Analgesie Meter [iHPAM, IITC Life Science Inc. (Woodland Hills, CA)]. Die Ausrüstung besteht aus mehreren Komponenten: eine Aluminium-Platte (10 x 20 cm) mit der Heizung und unter einer Plexiglas-Kammer über Beobachtung, ein Wärme-Steuereinheit, Software zur Datenerfassung (IITC Part # Soft-Series 8), ein PC (Personal Computer) und einem Fußschalter für Remote Start, Stop oder Reset-Steuerung des Gerätes. Die Heizung ermöglicht auch Start / Stopp / Rücksetzen des Heizprozesses manuell über eine Tastatur vor der Ausrüstung. Die iHPAM kann zu verschiedenen Heizraten, Standby / Ecktemperaturen eingestellt werden.

1. Ausstattung Set-up

1. Vor der Prüfung Tiere, das Gerät optisch untersuchen zu erhärten die gewählten Heizraten (z. B. 6 ° C / min), ursprünglichen Standby-und Final Cut-Off-Temperaturen (z. B. 28 ° C und 55 ° C, jeweils).
2. Überprüfen Sie alle Verbindungen. Um elektronische Kopie der Ergebnisse zu halten, muss das Gerät an einen Computer mit Software Series 8 angeschlossen werden. Alternativ können Ausdrucke der Ergebnisse erfolgt über die serielle Schnittstelle des Gerätes ausgedruckt werden.
3. Testen Sie das Telefon. Drücken Sie den Fußschalter einmal sicherstellen, dass die Software Series 8 zeichnet die Daten: Standby ersten, letzten Ecktemperaturen und Zeit in Sekunden erforderlich, um den Cut-Off-Temperatur zu erreichen.
4. Als eine weitere Kontrolle Test können die Forscher bei den Experimenten beteiligt brauchen, um das Gerät selbst zu erfahren. Zurückziehen der Hand von der Metallplatte im Moment der Schmerzwahrnehmung (46-48 ° C) darf weder schaden der Haut oder zur Erzeugung von beliebigen späteren Beschwerden.
5. Sobald das Gerät eingestellt wurde und die Ergebnisse aus den Schritten 1.3 und 1.4 erfasst sie verglichen werden können. Dies ist hilfreich, um mögliche Probleme, die die Verwendung des Geräts ungültig erkennen konnte. Zum Beispiel, Diskrepanzen zwischen anfänglichen Standby / Final Cut-off-Tempeturen und die eigentliche Lesung des Gerätes und / oder Unterschiede zwischen den Temperaturen von der Einheit und der tatsächlichen Temperatur der Platte für Hand Rückzug erforderlich angezeigt.

2. Testen normalen Tieren

Entweder junge oder erwachsene Wistar-Ratten [postnatale (p) Alter 21-25 Tage], oder Mäusen (p21-25) von einem genetischen Hintergrund oder Geschlecht genutzt werden kann. Die Mäuse in unseren Experimenten verwendet werden, der Stamm C57BL/6J.

1. In der Nacht zuvor die Experimente durchgeführt werden, die Tiere zu gewöhnen, indem man ihren Käfigen auf der Bank, wo die iHPAM platziert wird. Zwei Stunden vor Durchführung der Tests, auf dem iHPAM drehen, die Tiere mit der Geräuschkulisse des Gerätes vertraut zu machen. An diesem Punkt kann der iHPAM eingerichtet und getestet, um eine ordnungsgemäße Funktion zu überprüfen (siehe Schritt 1). Lebensmittel und Wasser ad libitum während der gesamten Prüfung zur Verfügung gestellt, außer wenn das Tier in der Beobachtung Kammer (siehe Schritt 2.1).
   Hinweis: Es ist important nicht anzunehmen, dass die Laborbedingungen in Verhaltensexperimente standardmäßig kontrolliert werden. Besondere Aufmerksamkeit sollte der genetischen und umweltbedingten Faktoren, die das Ergebnis der Verhaltensforschung (Übersicht in ⁷⁾ beeinflussen können, bezahlt werden.
2. Vorsichtig einen normalen Maus / Ratte in den Plexiglas-Kammer Beobachtung auf der Oberseite der Heizplatte des Gerätes. Lassen Sie das Tier auf der erwärmten Oberfläche (eingestellt auf 28 ° C) zu akklimatisieren, bis das Tier zeigt eine komfortable Verhalten.
   Hinweis: Unter diesen Bedingungen normalen erwachsenen Ratten zeigen einen ersten explorativen Verhalten, gelegentlich im Stehen auf den Deckel der Kammer während der Beobachtung Sniffing. Nach ein paar Minuten, kann Ratten zeigen lässig Anfälle von Grooming und ein entspanntes Verhalten. Manchmal lagen Ratten mit einer entspannten Körperhaltung (anfällig Verlängerung), während nebenbei schnüffelt die Umgebung. Normale Mäuse sind in der Regel aktiver als Ratten. Allerdings zeigen Mäuse eine entspannte Erkundungsverhalten nach wenigen Minuten in die Beobachtung Kammer. Es ist außerordentlich selten, um entweder zu entkommen Verhaltensweisen (zB Springen, versuchen, aus der Beobachtung Kammer zu entkommen) oder defensive Haltung (zB Quietschen) zu beobachten. Es ist auch wichtig zu beachten, dass Mäuse, können die Schmerzen von einer Maus zu einer anderen ^{8 zu} kommunizieren. Daher kann es wichtig sein, Versuchsmäuse in getrennten Käfigen.
3. Ort spiegelt in der Rückseite der Kammer Beobachtung, um Beobachtungen aus allen Winkeln zu ermöglichen. Ein Stativ im Besitz einer digitalen Videokamera kann hilfreich sein, den genauen Zeitpunkt, an dem nozifensiven (Schmerzen zu vermeiden) Verhalten eingetreten zu bestimmen.
4. Sobald das Tier ist bequem in der Beobachtung Kammer erwärmen sich die Platte durch Drücken der Fußschalter. Wenn die Temperatur der Platte heizt mit einer Rate von 6 ° C / Minute, zeigen normale Tiere nozifensiven Verhalten mit entweder Hinterbeine Pfote * in der Regel Temperaturen tobenden 46 bis 48 ° C ^3,5,9,10. Somit ist das Tier entfernt typischen Form der beobachtbarenation Kammer nach ca. 3 Minuten.
   Hinweis: Die Beachtung der typischen nozifensiven Reaktion einer Ratte oder Maus dh Hinterbeine Pfote leckt, unter Schütteln und / oder Heben, genügt, um den thermischen Reiz zu kündigen. Dies geschieht durch Drücken des Fußschalters erreicht. In diesem Moment nimmt die Software die Platte die Temperatur und die Platte sofort abkühlt, bis Standby-Temperatur (28 ° C) erreicht ist (~ 0,5 min). Diese Temperatur bedeutet, die auf das jeder nozifensiven Reaktion hervorruft als schädliche dem Schwellwert (TNT) der normalen (Kontrolle) Tieres.
   * Manchmal, vor allem bei Mäusen, kann nozifensiven Verhalten auf schädliche Temperatur zuerst in einer beobachtet werden oder beide Vorderpfoten (zB Lecken im Sitzen), wenige Sekunden vor Hinterpfoten. Allerdings ist Vorderpfote leckte ein normaler Bestandteil des Putzverhalten. Daher werden nur Hinterbeine Pfote Reaktionen beurteilt. In Gelegenheiten Mäuse können putzen ihre Hinterpfoten ebenso. Allerdings tun normalen Grooming not zuletzt mehr als ein paar Sekunden, nicht um intensive Lecken und endet in der Regel nach der Reinigung seine Krallen.
5. Entfernen Sie vorsichtig das Tier von der Platte und legen Sie sie in ihrer jeweiligen Käfig. Die Wärme Schwellenwertmesseinheit wird dann für andere Steuerelement (normal) tierischen wiederholt.
   Hinweis: TNTs bei einem Tier in Intervallen von 1-2 Minuten, ohne das Tier aus der Beobachtungskammer bestimmt werden. TNT Bestimmungen an Ratten oder Mäusen kann mehrere Male während mehreren Tagen wiederholt werden. Dies ist besonders nützlich, um die mittlere TNT eines einzelnen Tieres sowie seine Variation mit dem Alter zu bestimmen.
6. Die TNT Kontrolltieren wird als Mittelwert von drei oder mehr Schwellenwerte ± SEM ausgedrückt.
7. Die statistische Analyse der gewonnenen Daten wird durchgeführt, um eine unterschiedliche Behandlung Gruppen von Mäusen oder Ratten zu vergleichen. Parametrische Verfahren einschließlich Analysis of Variance kann in geeigneter Weise eingesetzt werden, wo Daten normal verteilt sind und wo Behandlungsgruppen sind Homoskedastic, wenn diese Bedingungen erfüllt wurden folgende Ansätze angewendet werden können. Analyse der Varianz durch den Newman-Keuls-Test, um Unterschiede in mehrere Messungen bedeutet, wiederholt einzelne TNTs mit / ohne Behandlung oder zu verschiedenen Zeitpunkten (zB Daten in 3) zu erfassen, gefolgt. Die gepaarten Student-t-Test verwendet werden, um zwei Datengruppen bedeutet, TNTs vor vs vergleiche nach der Arzneimittelbehandlung werden, die ungepaarten t-Test verwendet werden, um Unterschiede in TNT Veränderungen zu bestimmen vs Vehikel behandelten Tieren Medikament behandelt (z. B. Daten, die in Abbildung 4).

3. Testen diabetischen Tieren

Die Streptozotocin (STZ)-induzierten diabetischen Ratte ist das am häufigsten verwendete Tiermodell, um die Mechanismen der PDN zu untersuchen und Analgetika und Therapien ^11,12 beurteilen. Diabetisch gemachten Ratten, von einer einzigen intraperitonealen Dosis von STZ (60 mg / kg) kann be für thermische Hyperalgesie während des ^3. Woche nach dem Ausbruch von Diabetes ¹¹ getestet. Es ist wichtig zu beachten, dass nicht alle diabetischen Ratten PDN zu entwickeln. Allerdings können Tiere, die Hyperalgesie (~ 50%) entwickeln kann leicht identifiziert werden. Tatsächlich sind ihre TNTs niedriger als normal *.

* Um TNTs von STZ-diabetischen Ratten zu bestimmen, ein Ausgangspunkt Platte Temperatur von 15 ° C statt 28 ° C verwendet wird. Der Grund für diese Änderung ist, dass die meisten diabetischen Tieren mit PDN wird erwartet, dass hyperalgetische ^2,11 sein. Deshalb werden sie haben weniger als normale schädliche Hitze Schwellenwerte (zB <45 ° C).

1. Ein diabetischen Ratte wird in der jeweiligen Kammer auf der Oberseite der Prüfvorrichtung verwendet wird. Das Tier erlaubt ist, zu der Plattenoberfläche akklimatisieren, bis das Tier eine komfortable Verhalten.
   Hinweis: Typischerweise wird eine diabetische Ratten zeigen nicht viel von dem normalen Verhalten. Diabetischen Ratten sind in der Regel hypoactive, lethargisch; oft zeigeneingeschränkten Bewegungen und langsamen Pflege. Es ist selten, Tabellenführer gegen den Deckel der Kammer Beobachtung zu beobachten. Nach wenigen Minuten kann diabetischen Ratten ruhig in einer Ecke der Kammer bleiben mit Casual Schnüffeln auf die Umgebung.
2. Sobald der diabetischen Tieren ist bequem in der Beobachtung Kammer wird die Platte wie in Schritt 2.3 der diabetischen Ratte nozifensiven Verhalten entweder mit Hinterbein / Vorderpfote aufweisen kann erwärmt werden. Dies geschieht meist bei nicht-schädliche Platte Temperaturen (zB <45 ° C), oder spätestens nach 5 Minuten in der Kammer mit dem 6 ° C / min Temperaturanstieg.
   Hinweis: Die nozifensiven Reaktion eines jungen Erwachsenen diabetischen Ratte nicht von der einer normalen Ratte unterscheiden. Jedoch ist die niedrigste Temperatur hervorzurufen solches Verhalten deutlich gesenkt.
3. Siehe Schritt 2.4
4. Der Mittelwert der mehr als drei Schwellen in der Tag des Experiments, ausgedrückt in ° C ± SEM wird als schädliche Hitze Schwelle des diabetic Tier.
   Hinweis: Ein ähnliches Paradigma zu dem einen erklärt, für den normalen oder diabetischen Ratten kann gefolgt, um die thermische anti-nozifensiven Wirkung von Schmerzmitteln bei der Wärme-Schwellenwerte zu bestimmen.

4. Testen Analgesie

Die antinozizeptive Eigenschaften von Arzneimitteln (zB Analgetika) sowie die Bestimmung der pharmakologischen Parameter wie die minimale wirksame Dosis kann leicht durch Verwendung der oben erläuterten Schritte erhalten werden. Es wird prognostiziert, dass geeignete Dosen eines Schmerzmittels verabreicht, um die Ratten / Mäusen deutlich erhöht würde ihre TNTs. Dies ist besonders empfindlich bei Tieren mit thermischer Hyperalgesie ^3. Jedoch von Verzerrungen bei der Interpretation der Ergebnisse zu vermeiden, müssen die Ermittler in der Verhaltensbeobachtung eines Tieres Gruppe beteiligt oder nicht, bewusst sein, wenn die Tiere behandelt worden waren oder nicht. Ferner können Arzneimittel, die von dem Beobachter injiziert werden von einem anderen Ermittler hergestellt werden und gekennzeichnetA, B, C, etc. Dosierung in einem Ausdruck bereitgestellt, Einzeldosen pro Eintrag identifizierte Tier.

Je nach der Droge getestet, kann verschiedene Dosen eines potentiellen Analgetikum zur normalen oder diabetischen Tieren 5-15 min vor Verhaltenstests verabreicht werden. Entsprechenden Kontrollen einzubeziehen (dh im Alter passende Fahrzeug mit Tieren injiziert, allein und / oder diabetischen Ratten ohne PDN) und getestet werden unter Verwendung von identischen Bedingungen (zB gleiche Starttemperatur der Platte). Chronische Wirkungen von Drogen kann ebenso getestet werden.

5. Repräsentative Ergebnisse

Die niedrigste Temperatur der Platte hervorzurufen nozifensiven Reaktionen in beiden Hinterbeine Pfote von jungen erwachsenen normalen nicht-behandelten Ratten oder Mäusen bestimmt wurden folgende Schritte 2-1 bis 2-6. Wie in Abbildung 1, TNT von normalen jungen erwachsenen Ratten und Mäusen gezeigt, waren 47,2 ± 0,2 ° C und 47,5 ± 0,5 ° C sind.

Wir haben Observed weder signifikante Tagesverlauf der individuellen TNTs (Abbildung 2A), noch wesentliche Änderungen von TNTs zwischen den Individuen des gleichen Alters (Abbildung 2B). TNT Unterschiede bezüglich Geschlecht wurden nicht beobachtet (nicht gezeigt).

TNTs von jungen erwachsenen STZ-diabetischen Ratten wurden in einer ähnlichen Weise wie bei normalen Ratten (Schritte 3.1 bis 3.3) bestimmt. Allerdings fiel der Startschuss Platte die Temperatur auf 15 ° C statt 28 ° C. Die nozifensiven Verhalten STZ-diabetischen Ratten wurde mindestens dreimal in einem Individuum und in einer täglichen Mode Startelf Tage nach der Injektion STZ bewertet. Wie in Abbildung 3, ein deutlicher Rückgang (p <0,01) in den TNT von STZ-diabetischen Ratten gezeigt wird deutlich, zwei Wochen nach der STZ Injektion. Die mittlere TNT von STZ-diabetischen Ratten war 45,6 ± 0,1 ° C (n = 16, gepoolten Werte von 14 bis 23 Tage).

Diabetischen Ratten zeigen signifikant niedrigere TNT als Normal wurden als PDN haben. Diese Ratten wurden verwendet, um die akute antinozizeptive Eigenschaften eines Analgetikums (Verbindung A) zu testen. TNTs wurden in normalen und diabetischen Ratten entweder mit einer einzelnen Dosis der Verbindung oder Vehikel allein fünf Minuten vor dem Test injiziert bestimmt. Wie in 4 gezeigt, eine einzelne intraperitoneale Dosis der Verbindung deutlich TNTs von diabetischen Ratten erhöht, wenn die Ratten mit Vehikel allein (45,6 ° C 47,6 ° C vs, jeweils) behandelt wurden. Die Anti-nozifensiven Wirkung der Verbindung A wurde auch in normalen Ratten beobachtet, obwohl signifikant (p <0,01), es war weniger ausgeprägt (47,4 ° C vs 48,0 ° C, jeweils).

Abbildung 1. Bestimmung von TNTs der normalen jungen erwachsenen Ratten oder Mäuse: Die TNTs von jungen erwachsenen Ratten (P21-24) oder Mäusen (p20-21) wurden in der folgenden getesteten iHPAM die beschriebenen Schritte above. Insgesamt 12 Ratten und 25 Mäuse wurden getestet. Die Messungen wurden mehrere Tage lang durchgeführt und die Ergebnisse wurden gepoolt. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Die minimale und maximale Werte TNT bei diesen Ratten aufgezeichnet waren 46,2 ° C und 48,6 ° C bzw.. Bei Mäusen waren die maximalen und minimalen Werte aufzuzeichnen TNT 48,8 ° C und 44,9 ° C eingestellt.

Abbildung 2. Altersabhängigkeit von TNTs bei Ratten und Mäusen: A) Dargestellt sind die TNTs von vier normalen Ratten (n = 4) von 21 Tagen nach Alter bestimmt mindestens dreimal täglich während 5 Tagen B) TNTs von Mäusen Wurfgeschwister einmal angegeben bestimmt. Altersgruppen. Die Zahlen auf jeder Bestimmung Punkt stellt die Anzahl der Wurfgeschwister verwendet.

Abbildung 3. Diabetischen Ratten geworden hyperalgetische 3 haben wireks nach dem Auftreten von Diabetes: TNTs von sechs (n = 6) altersangepassten jungen Erwachsenen STZ-diabetischen Ratten bestimmt täglich ab 11 Tage nach der Induktion von Diabetes. Gezeigt werden täglich TNT Durchschnitte (Mittelwert ± SEM). Diabetische TNTs zwischen 11-13 Tage nach der Injektion bestimmt STZ waren im normalen Bereich (rote Linie). Zwei Wochen nach STZ Injektion TNTs deutlich zurückgegangen auf 45,1 ± 0,4 ° C, (p <0,05).

Abbildung 4. Akute Anti-nozifensiven Auswirkungen der Verbindung B in STZ-diabetischen Ratten. Young adult normalen Ratten (blaue Gruppe n = 12) und dem Alter angepasst STZ-diabetischen Ratten Hyperalgesie (grüne Gruppe n = 6) in der iHPAM wurden nach intraperitonealer Injektion von Fahrzeug getestet (dunkle Balken) oder Verbindung A (helle Balken). Die mittlere TNT ± SEM für jede Behandlung (Fahrzeugsteuerung oder Verbindung A-behandelten) dargestellt. Sternchen gekennzeichnet statistischen Unterschiede(P <0,05).

Diskussion

Ähnlich wie bei der klassischen Kochplatte Test auf thermische Hyperalgesie ^4,13 quantifizieren, beschrieb der Test der Nozizeption hier erlaubt einen schnellen und zuverlässigen Weg, um nozifensiven Verhalten bei Ratten und Mäusen zu quantifizieren. Im Gegensatz zu klassischen Test, ist das inkrementelle Hot-Plate-Verfahren nicht-invasiv und praktisch stressfrei. Obwohl einige zurückhalten ist notwendig, um den Test durchzuführen (dh das Tier muss in der Beobachtung Kammer sein), werden Ratten ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Firma	Katalog-Nummer
Inkrementelle Hot-Plate Analgesie Meter	IITC Life Science Inc.	Part # PE34
Soft-Serie 8	IITC Life Science Inc.	Part # Series8
Streptozotocin	Calbiochem	572201