Síntesis combinatoria y de alto rendimiento liberación de proteínas de película de polímero y nanopartículas Bibliotecas

Resumen

Este método describe la síntesis combinatoria de película polianhídrido biodegradable y bibliotecas de nanopartículas y la detección de alto rendimiento de liberación de proteína a partir de estas bibliotecas.

Resumen

Polianhídridos son una clase de biomateriales con excelente biocompatibilidad y la capacidad de administración de fármacos. Mientras que se han estudiado ampliamente con convencional de una muestra-en-un-tiempo las técnicas de síntesis, una más reciente de alto rendimiento enfoque ha sido desarrollado que permite la síntesis y ensayo de grandes bibliotecas de polianhídridos ^1. Esto facilitará la optimización más eficaz y el proceso de diseño de estos biomateriales para aplicaciones de administración de fármacos y vacunas. El método en este trabajo se describe la síntesis combinatoria de película polianhídrido biodegradable y bibliotecas de nanopartículas y la detección de alto rendimiento de liberación de proteína a partir de estas bibliotecas. En este método robóticamente operado (Figura 1), actuadores lineales y bombas de jeringa son controlados por LabVIEW, que permite un protocolo automatizado de manos libres, la eliminación de un error del usuario. Además, este método permite la fabricación rápida de micro-escala de bibliotecas de polímero, rojoucing el tamaño de lote, mientras que resulta en la creación de sistemas de polímeros multivariantes. Este enfoque combinatorio para la síntesis de polímeros facilita la síntesis de hasta 15 diferentes polímeros en una cantidad equivalente de tiempo que tomaría para sintetizar un polímero convencional. Además, la biblioteca combinatoria polímero se pueden fabricar en geometrías en blanco o cargado en proteínas que incluyen películas o nanopartículas la disolución de la biblioteca de polímero en un disolvente y la precipitación en un no disolvente (por nanopartículas) o por secado al vacío (para películas). Al cargar una proteína conjugado a un fluorocromo en las bibliotecas de polímero, la cinética de liberación de proteína puede ser evaluado en alto rendimiento utilizando un método de detección basado en la fluorescencia (Figuras 2 y 3) como se ha descrito anteriormente ^1. Esta plataforma combinatoria ha sido validado con métodos convencionales ² y la película de polianhídrido y bibliotecas de nanopartículas se han caracterizado con in vitro toxicidad celular, la producción de citoquinas, la expresión marcador de superficie, la adhesión, la proliferación y la diferenciación, y la biodistribución in vivo y mucoadhesión ^1-11. El método combinatorio desarrollado en la presente memoria permite un alto rendimiento de la síntesis del polímero y la fabricación de proteína cargada por nanopartículas y bibliotecas de película, que puede, a su vez, se proyectará in vitro e in vivo para la optimización del rendimiento de biomaterial.

Protocolo

1. Combinatoria Síntesis de polímero Library (Variando en Química de Polímeros) - ver figura 1 para la instalación robótica

1. Disolver cada monómero en el disolvente apropiado (concentración = 25 mg / ml) y cargar cada uno en una jeringa estanca al gas de 10 cc.
2. Una los tubos resistentes a disolventes bloqueo señuelo capilares hasta el final de cada jeringa.
3. Coloque las jeringas en las bombas de jeringa (New Era Bombas de jeringa programables) y bloquear en su posición.
4. Establecer los actuadores lineales (Zaber) a la posición inicial.
5. Con las abrazaderas de soporte de anillo, colocar el extremo de los dos tubos capilares en el vial de partida / pocillo para la deposición de monómero.
6. Iniciar el programa LabVIEW, que bombea volúmenes variables de cada monómero en cada pocillo dependiendo de la composición del copolímero deseado. Esto se consigue en el programa, instruyendo al accionador de eje Z para bajar los tubos capilares en el vial / pocillo y luego cada bomba para dispensar el volumen deseado. Nordestext, el programa indica al Z-actuador para volver a su posición inicial y los X-e Y-actuadores para mover a la posición de la siguiente vial / pocillo. Esto se lleva a cabo hasta que cada pocillo tiene el volumen deseado de monómero depositado en él.
7. Después de la deposición de monómero, el monómero de biblioteca de múltiples pocillos o multi-vial se transfiere a un horno de vacío precalentado y se incubaron a vacío durante la duración de la reacción de polimerización por condensación. Para CPH: síntesis de SA, la reacción se lleva a cabo a 180 ° C, 0,3 torr, durante 1,5 horas, pero estas condiciones de reacción pueden variar entre diferentes sistemas de polímeros.

2. Blank Combinatoria y Proteína-cargado de nanopartículas de polímeros y Fabricación Filmoteca - ver figura 1 para la instalación robótica

1. La jeringa en la bomba de jeringa programable primero se llena con un disolvente (biblioteca en blanco) o un disolvente con la proteína dispersa en ella (proteína cargada por biblioteca) mientras que la jeringa en la segunda jeringabomba se deja vacío. Tubos para la fabricación de nanopartículas en el soporte de muestras adyacentes se llenan con el no disolvente (relación de disolvente a no disolvente es de 1 a 100). Para la fabricación de una película de vacío de múltiples pocillos placa se utiliza en lugar de los tubos en el soporte de la muestra adyacente.
2. Usando el programa LabVIEW, el disolvente se deposita en todos los viales de polímero / pozos de la biblioteca (concentración = 20 mg / ml) y se incubaron durante 1-5 min. Un paso opcional sonicación (30 s a 40 Hz) se puede introducir para asegurar la disolución completa polímero.
3. A continuación, mediante el inicio de un programa separado de LabVIEW, la muestra se retira en la jeringa vacía, y se deposita en su tubo correspondiente de bien no disolvente (nanopartículas) o vacío (películas) en el soporte de muestras adyacentes.
4. Este proceso se lleva a cabo para cada composición de la biblioteca discreta de polímero.
5. La nanopartícula o biblioteca de película se coloca entonces en una cámara de vacío para la eliminación de disolvente y no disolvente-(libra la nanopartículary también se pueden recuperar mediante filtración al vacío).

3. De alto rendimiento Cinética proteína de liberación

1. Para el estudio de alto rendimiento de la cinética de liberación de proteína a partir de una biblioteca de polímero, un 96 profundas llenaron (2 ml / pocillo), placa de polipropileno se modifica de modo que el 1/3 superior de la pared del pocillo de las columnas vecinas (ex: A y B, C y D, E y F, G y H) se elimina para unir los pozos. Las películas cargadas de proteínas deben ser fabricados en o las nanopartículas transferido a esta placa para llevar a cabo de alto rendimiento estudios de cinética de liberación. Las muestras de proteína cargada por nanopartículas o película sólo debe ser colocado en un pocillo de las columnas contiguas (ex: A, C, E, y G). Ver la Figura 4 para los detalles.
2. Tras la transferencia de las nanopartículas a la placa de liberación 96 se llenaron profundas, las partículas se dejan sedimentar. Tampón PBS (0,1 mM, pH 7,4) se añade lentamente a cada pocillo de muestra (columnas A, C, E y G) y después a cada vecino bien (columnas B, D, F, y H) hasta que los pozos están llenos y el tampón es de flujo libre entre pozos adyacentes. Para las nanopartículas, este proceso debe llevarse a cabo con sumo cuidado para asegurar que las partículas permanecen en la parte inferior de la muestra así (columnas A, C, E y G) y no se transfieren a la liberación contigua bien (columnas B, D, F , y H). En algunos casos, la centrifugación se requiere para localizar las muestras de nanopartículas en la parte inferior de la muestra así (columnas A, C, E y G).
3. A continuación, la placa de liberación está sellado con una tapa y se coloca a la temperatura deseada (es decir, 37 ° C) bajo agitación durante la duración del experimento.
4. En los puntos de tiempo incremental (es decir, 0,04, 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12, 15, 19, 24, y día 30) la cantidad de conjugado a un fluorocromo liberado proteína se cuantificó usando un escáner de fluorescencia Typhoon 9.400 caja plana ( GE Healthcare). La placa de liberación se coloca en la superficie del escáner, escanea con el láser de excitación apropiada y las emisiones filteRS, y la intensidad de fluorescencia de la proteína liberada en los pocillos de liberación (columnas B, D, F y H) se cuantifica (Image Quant). Se sugiere que los patrones de proteína de concentraciones conocidas se incluyen en la placa de pocillos para el cálculo de la cantidad de proteína y la contabilidad de enfriamiento fluorocromo.

4. Los resultados representativos

Tras la fabricación de la biblioteca de polímero, la caracterización se llevó a cabo con ¹ H RMN, GPC, y FTIR para validar este método combinatorio ^1,7,8,11. Intervalo de pesos moleculares de 10.000-20.000 g / mol, índice de polidispersidad varía desde 1,5 hasta 3,0, y la composición química se ha demostrado que es exacta y de acuerdo con los métodos convencionales de síntesis polianhídrido ^12-15. Del mismo modo, las imágenes SEM de las bibliotecas de nanopartículas mostró morfología de la superficie similar, tamaño, y distribución de tamaño que el de las nanopartículas fabricadas convencionalmente ^2. Proteína de liberación kinetics a partir de nanopartículas de polianhídrido o películas se lleva a cabo en una placa modificada así como se ha descrito anteriormente ^1. Los resultados mostraron una liberación aproximada de orden cero con o sin una explosión depende de la carga de proteínas y la química de polímeros (Figuras 2 y 3) ^1,12,14,16.

Figura 1. Combinatoria de película de polímero y aparato de fabricación de nanopartículas.

Figura 2 de alto rendimiento de liberación de Texas Red albúmina de suero bovino (TRBSA) de un CPH:. SA biblioteca de nanopartículas de polímero. SA-ricos polímeros químicos liberar encapsulado TRBSA el más rápido, mientras CPH-ricos polímeros químicos liberar el más lento. Las barras de error representan la desviación estándarción y n = 4. Reproducido con el permiso de Petersen et. al. ^1. Copyright 2010 American Chemical Society.

Figura 3 High-throughput liberación de Texas Red albúmina de suero bovino (TRBSA) de un CPTEG:. CPH biblioteca de película de polímero. CPTEG ricos en química de polímeros liberan encapsulado TRBSA el más rápido, mientras CPH-ricos polímeros químicos liberar el más lento. Las barras de error representan la desviación estándar y n = 3.

Figura 4. Imagen que muestra dos pozos vecinos "antes" y "después de" modificación en la placa de polipropileno de 96 profundo brotó. El "después" modificación de la derecha también describe la adición de una película de polímero (parte inferior izquierda de la cavidad) con una molécula fluorescente encapsuladode ser liberado entre las dos pozos en una solución tampón. La molécula fluorescente liberado se detecta luego en la derecha también.

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Discusión

El conocimiento de las condiciones de síntesis necesarias y las temperaturas de transición vítrea _(Tg s) de los polímeros que se sintetizaron son esenciales para la fabricación de biblioteca. Si la _Tg s están por debajo de la temperatura ambiente, la etapa de fabricación de nanopartículas puede ser necesario llevar a cabo en un ambiente de temperatura controlada por debajo de la _Tg de los polímeros. Además, se debe tener cuidado para asegurar que todo el equipo que entra en con...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre	Empresa	El número de catálogo
Motorizado XYZ Stage: 3x T-LSM050A, 50 mm recorrido por eje	Zaber Tecnologías	T-XYZ-LSM050A KT04-
NE-1000 Bomba de Jeringa individual	Nuevos Sistemas de siglos de la bomba	NE-1000
Pyrex * Vista * reutilizables tubos de cristal sin montura Cultura	Corning	07-250-125
Las cubetas de vidrio	Estrategias Científicas	G102
LabVIEW	National Instruments	776671-35
SGE estanca al gas, jeringas Luer Loc	Sigma Aldrich	509507
U96 DeepWell placas 1,3 ml y 2,0 ml	Thermo Scientific: Nunc	278743
Bueno esteras de cabeza	Thermo Scientific: Nunc	276000
Typhoon 9400	GE Healthcare	63-0055-79
Whatman Grado 50 Círculos de 90 mm	Whatman	1450-090