Комбинаторного синтеза и высокая пропускная способность белка Освобождение от полимерной пленки и наночастицы библиотеки

Резюме

Этот метод описывает комбинаторного синтеза биологически фильм полиангидрид и наночастиц библиотек и высокую пропускную способность обнаружения белка освобождение от этих библиотек.

Аннотация

Полиангидриды представляют собой класс биоматериалов с превосходной биосовместимостью и возможности доставки лекарств. В то время как они были изучены с обычными один образец-на-времени методы синтеза, более поздняя высокой пропускной подход был разработан позволяя синтеза и испытаний крупных библиотек полиангидриды ^1. Это будет способствовать более эффективной оптимизации и процесс проектирования этих биоматериалов для применения лекарств и вакцин доставки. Метод В этой работе описывается комбинаторного синтеза биологически фильм полиангидрид и наночастиц библиотек и высокой пропускной способностью обнаружения белка освобождение от этих библиотек. В этой управлением робота методом (рис. 1), линейные приводы и шприцевые насосы находятся под контролем LabVIEW, которая позволяет громкой автоматизированный протокол, устраняя ошибки пользователя. Кроме того, этот метод позволяет быстро изготовления микро-масштабе библиотеки полимера, красныйucing размер пакета в то время как в результате создания многовариантной системы полимер. Это комбинаторный подход к синтезу полимеров способствует синтезу до 15 различных полимеров в эквивалентное количество времени, которое потребуется для синтеза одного полимера условно. Кроме того, библиотека комбинаторного полимеров могут быть изготовлены в пустой или белка загруженных геометрии в том числе фильмов или наночастиц при растворении в библиотеке полимера в растворителе и осадки в не-растворитель (наночастиц) или вакуумной сушки (для пленок). При загрузке флуорохромом сопряженных белка в библиотеках полимеров, кинетики белка выпуска может быть оценена на высокой пропускной способности, используя флуоресценции на основе метода обнаружения (рис. 2 и 3), как описано ранее ^1. Это комбинаторное платформа была подтверждена с помощью традиционных методов ² и фильм полиангидрид и наночастиц библиотеки были характеризуются токсичность лабораторных клеточных, продукция цитокинов, поверхностных маркеров выражения, адгезию, пролиферацию и дифференцировку, а также в естественных условиях биораспределения и мукоадгезия ^1-11. Комбинаторный метод, разработанный здесь обеспечивает высокую пропускную способность синтеза полимеров и производства белково-загруженных наночастиц и кино библиотек, которые, в свою очередь, будет показан в пробирке и в естественных для оптимизации производительности биоматериала.

протокол

1. Комбинаторные библиотеки Синтез полимерных (Изменение в химии полимеров) - см. Рисунок 1 Роботизированная установка

1. Растворите каждого мономера в соответствующем растворителе (= концентрация 25 мг / мл) и загружать каждую в 10cc газонепроницаемого шприца.
2. Прикрепить растворителям приманки замок капилляров в конце каждого шприца.
3. Положите шприц на шприц насосов (New Era Программируемый насос шприца) и зафиксируйте в этом положении.
4. Установить линейные приводы (Zaber) в исходное положение.
5. Использование зажима кольца стенда, поместить конец обоих капилляров в стартовый флакон / а для мономера осаждения.
6. Инициировать программу LabVIEW, который насосов переменного объема каждого мономера в каждую лунку в зависимости от желаемого состава сополимера. Это достигается в программе инструктажа Z-оси привода, чтобы снизить капилляра в пробирку / ну а потом каждый насос для дозирования требуемого объема. НебраскаXT, программа предписывает Z-приводом, чтобы вернуться в исходное положение и X-и Y-приводы для перехода к позиции следующего флакон / а. Это осуществляется до каждой скважины желаемый объем мономера на хранение в нее.
7. После осаждения мономера, мульти-хорошо или нескольких флаконов мономера библиотеки переведены в предварительно нагретую вакуумную печь и выдерживают под вакуумом для продолжительности реакции полимеризации конденсации. Для CPH: SA синтеза реакцию проводят при 180 ° С, 0,3 торр, в течение 1,5 часа, но эти условия реакции будут разными в различных полимерных систем.

2. Комбинаторные Бланк и белка загруженных наночастиц полимеров и изготовление фильмов Библиотека - см. рисунок 1 для роботизированной установки

1. Шприц в первый программируемый шприцевой насос заполнен растворителя (пустой библиотеке) или растворителя с белком, диспергированные в ней (белка загруженной библиотеке), а шприц во втором шприцеНасос остается пустым. Трубы для изготовления наночастиц в соседних держатель образца заполняются без растворителя (отношение растворителя к нерастворителя составляет от 1 до 100). Для изготовления фильм пустой мульти-луночный планшет используется вместо труб в соседних держатель образца.
2. Используя программу LabVIEW, растворитель хранение во всех полимеров флаконов / скважин библиотеки (концентрация = 20 мг / мл) и выдерживают в течение 1-5 мин. Необязательный этап обработки ультразвуком (30 с при 40 Гц) может быть введен, чтобы обеспечить полное растворение полимера.
3. Далее, путем инициирования отдельную программу LabVIEW, образец отозвана в пустой шприц и хранение в соответствующую трубку не содержащих растворителей (наночастиц) или пустой колодец (фильмов) в соседних держатель образца.
4. Этот процесс осуществляется для каждой композиции дискретных библиотеки полимеров.
5. Наночастиц или фильмотеку затем помещают в вакуумную камеру для растворителя и не удаление растворителя (наночастицы Весыры могут быть восстановлены с помощью вакуумной фильтрации).

3. Высокая пропускная способность Кинетика белка релиз

1. Для расследования высокой пропускной кинетики белка освобождение от библиотеки полимера, 96 глубоких навернулись (2 мл / лунку), полипропилена пластины модифицированы таким образом, что верхняя 1/3 от стенки скважины в соседних столбцах (например: А и Б, C и D, E и F, G и H) удаляется примыкать к скважинам. Белка загруженных фильмов должны быть изготовлены или наночастицы переносили в этой пластины для выполнения высокой пропускной кинетики высвобождения исследований. Белки загруженных наночастиц или пленки образцы должны быть размещены только в одной скважине соседней колонны (например: A, C, E и G). См. Рисунок 4 для деталей.
2. После переноса наночастиц в 96 глубоких навернулись релиз пластинки, частицы осаждаются. PBS буфера (0,1 мМ, рН 7,4) медленно добавляют к каждому образцу и (столбцы A, C, E и G), а затем к каждой соседней скважины (столбцы B, D, F и H), пока скважин полной и буфер сыпучих между соседними скважинами. Для наночастиц, этот процесс должен проводиться с особой осторожностью, чтобы обеспечить частицы остаются на дне лунки (столбцы A, C, E и G) и не передаются в соседнюю релизе хорошо (столбцы B, D, F и H). В некоторых случаях, центрифугирования, необходимое для локализации наночастиц образца на дне лунки (столбцы A, C, E и G).
3. Далее, релиз пластинки закрыты крышкой и помещают в нужной температуры (например, 37 ° C) при перемешивании в течение всего срока эксперимента.
4. В дополнительных временных точках (0,04 т.е. 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12, 15, 19, 24 и 30 дней) сумма выпустила флуорохромом сопряженных белок количественно, используя 9400 Typhoon планшетный сканер флуоресцентные ( GE Healthcare). Выпуск пластина помещается в сканер поверхности, проверенных с помощью соответствующего лазерного возбуждения и испускания FilteRS, и интенсивность флуоресценции белка выпущен в релиз скважин (столбцы B, D, F и H) количественно (Image Quant). Предполагается, что белок стандарты известных концентраций быть включены в луночный планшет для расчета количества белка и учета флуорохромом закалки.

4. Представитель Результаты

При изготовлении полимера библиотеки, характеристика была проведена с ¹ Н-ЯМР, GPC, и ИК для проверки этой комбинаторный метод ^1,7,8,11. Молекулярная диапазон веса от 10,000-20,000 г / моль, диапазон полидисперсности от 1.5-3.0, и химическому составу было показано, быть точными и в согласии с традиционными методами синтеза полиангидрид ^12-15. Кроме того, СЭМ изображения наночастиц библиотеки показали аналогичные морфологии поверхности, размер и распределение по размерам, как и обычно изготовлены наночастицы ^2. Белки выпуска kinetiCS от полиангидрид наночастиц или фильмов осуществляется в измененном также пластины, как описано ранее ^1. Результаты показали, приближенных нуля выпуска порядке с или без всплеска зависит от нагрузки белка и химии полимеров (рис. 2 и 3) ^1,12,14,16.

Рисунок 1. Комбинаторные полимерной пленки и устройство изготовления наночастиц.

Рисунок 2 Высокая пропускная выпуск Texas Red бычьего сывороточного альбумина (TRBSA) от CPH. SA полимер наночастицы библиотеки. SA богатый полимера химические выпустить инкапсулированные TRBSA наиболее быстро, в то время как CPH богатых химии полимеров выпустит самый медленный. Планки погрешностей представляют стандартное отклонениения и п = 4. Печатается с разрешения Петерсен и др.. ал. ^1. Copyright 2010 American Chemical Society.

Рисунок 3 Высокая пропускная выпуск Texas Red бычьего сывороточного альбумина (TRBSA) от CPTEG. CPH полимерной пленки библиотеки. CPTEG богатых химии полимеров выпустить инкапсулированные TRBSA наиболее быстро, в то время как CPH богатых химии полимеров выпустит самый медленный. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение и п = 3.

Рисунок 4. Изображение с изображением двух соседних скважин "до" и "после" модификации в 96 глубоких навернулись полипропиленовые плиты. "После" модификации изображение справа также показаны добавлением полимерной пленки (в нижней части левой а) с закрытым флуоресцентные молекулывыпускается двух скважин в буферный раствор. Выпустила флуоресцентные молекулы, то обнаружил в правой хорошо.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Знания необходимые условия синтеза и температуры стеклования (T _г ы) полимеров синтезируется имеют важное значение для библиотеки изготовления. Если T _{^ S} ниже комнатной температуры, шаг наночастиц изготовление, возможно, придется проводить в контролируемых условиях темпер?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Имя	Компания	Номер в каталоге
Моторизованный XYZ этап: 3x T-LSM050A, 50 мм хода на ось	Zaber технологий	T-XYZ-LSM050A-KT04
NE-1000 один насос шприца	Новые насосные системы Эпоха	NE-1000
Pyrex * Vista * Rimless многоразовые стеклянные трубки культуры	Гранулирование	07-250-125
Стеклянные кюветы	Научно Стратегии	G102
LabVIEW	National Instruments	776671-35
SGE газонепроницаемого шприца, Луер Лок	Sigma Aldrich	509507
U96 Deepwell пластины 1,3 мл и 2,0 мл	Thermo Scientific: Nunc	278743
Ну коврики крышкой	Thermo Scientific: Nunc	276000
Тайфун 9400	GE Healthcare	63-0055-79
Ватман класс 50 кругов 90 мм	Ватман	1450-090