Kombinatorische Synthese von und High-Throughput-Protein Release von Polymer Film-und Nanopartikel-Bibliotheken

Zusammenfassung

Diese Methode beschreibt die kombinatorische Synthese von biologisch abbaubaren Polyanhydrid Film-und Nanopartikel-Bibliotheken und die Hochdurchsatz-Detektion von Protein-Freisetzung aus diesen Bibliotheken.

Zusammenfassung

Polyanhydride sind eine Klasse von Biomaterialien mit exzellenten Biokompatibilität Droge Lieferfähigkeit. Während sie wurden ausgiebig mit der studierten herkömmlichen Ein-Stichproben-at-a-time-Synthese-Technologien, eine neuere High-Throughput-Ansatz entwickelt ermöglicht die Synthese und Erprobung von großen Bibliotheken Polyanhydride ^1. Dies erleichtert eine effizientere Optimierung und Design-Prozess dieser Biomaterialien für Drogen-und Impfstoff-Delivery-Anwendungen. Das Verfahren in dieser Arbeit beschreibt die kombinatorische Synthese von biologisch abbaubaren Polyanhydrid Film-und Nanopartikel-Bibliotheken und die Hochdurchsatz-Detektion von Protein-Freisetzung aus diesen Bibliotheken. In diesem Roboter betriebene Verfahren (Abbildung 1) werden lineare Aktuatoren und Spritzenpumpen von LabVIEW, die eine Freisprecheinrichtung automatisierten Protokoll ermöglicht, wodurch Anwenderfehler gesteuert. Darüber hinaus ermöglicht dieses Verfahren die rasche Herstellung von Mikro-Maßstab Polymer Bibliotheken, rotenucing die Chargengröße während was zur Schaffung multivariante Polymersystemen. Diese kombinatorische Ansatz zur Synthese von Polymeren ermöglicht die Synthese von bis zu 15 verschiedene Polymere in eine äquivalente Menge an Zeit, die für ein Polymer konventionell synthetisieren würde. Darüber hinaus kann die kombinatorische Bibliothek in freilassen Polymer oder Protein-beladenen Geometrien einschließlich Filmen oder Nanopartikel beim Auflösen des Polymers Bibliothek in einem Lösungsmittel und Ausfällen in einem Nichtlöser (z. Nanopartikel) oder durch Vakuumtrocknung (für Folien) hergestellt werden. Nach dem Laden eines Fluorochrom-konjugierten Proteins in die Polymer-Bibliotheken kann Protein Freisetzungskinetik bei hohem Durchsatz untersucht werden mit Hilfe eines Fluoreszenz-basierten Detektionsverfahren (Abbildungen 2 und 3), wie zuvor beschrieben ^ein. Diese kombinatorische Plattform wurde mit konventionellen Methoden validiert wurden ² und das Polyanhydrid Film-und Nanopartikel-Bibliotheken wurden mit geprägt in vitro zelluläre Toxizität, Zytokin-Produktion, Oberflächenmarker Ausdruck, Adhäsion, Proliferation und Differenzierung, und in vivo Bioverteilung und Mucoadhäsion ^1-11. Die kombinatorischen Methode entwickelt hierin ermöglicht Hochdurchsatz-Polymer-Synthese und Herstellung von Protein-beladenen Nanopartikel und Filmbibliotheken, welche wiederum können, in vitro und in vivo zur Optimierung der Leistung Biomaterial gescreent werden.

Protokoll

Ein. Kombinatorische Polymer Library Synthesis (Wechselnde in Polymerchemie) - siehe Abbildung 1 für Robotic-Setup

1. Aufzulösen jedes Monomer in dem geeigneten Lösungsmittel (Konzentration = 25 mg / ml) und jeweils in eine geladen 10cc gasdichte Spritze.
2. Anbringen der lösemittelbeständigen Köder Sperre Kapillarröhren an das Ende jeder Spritze.
3. Legen Sie die Spritzen auf den Spritzenpumpen (New Era Programmable Spritzenpumpen) und einrasten.
4. Festlegen der Hubantriebe (Zaber) in die Ausgangsposition.
5. Verwendung Ring Stativklemmen Positionieren des Endes der beiden Kapillarröhrchen in die Ausgangsstellung Fläschchens / Vertiefung für Monomer Abscheidung.
6. Initiieren des LabVIEW Programm, das Pumpen variablen Volumina jedes Monomers in jede Vertiefung je nach der gewünschten Copolymerzusammensetzung. Dies wird in dem Programm durch Anweisen der Z-Achsen-Aktuator, um die Kapillarröhren in das Fläschchen / Vertiefung und dann jede Pumpe zu verringern, um das gewünschte Volumen abzugeben erreicht. Next, instruiert das Programm die Z-Stellglied in seine Ausgangsstellung und die X-und Y-Aktuatoren zurückzukehren, um zu der Position des nächsten Fläschchens / Vertiefung bewegen. Dies erfolgt, bis jede Vertiefung der gewünschte Volumen der Monomer abgeschieden hat hinein durchgeführt.
7. Nach Monomer Abscheidung wird der Multi-Well-oder Mehrglasmethode Monomer Bibliothek, um eine vorgewärmte Vakuumofen überführt und unter Vakuum für die Dauer der Kondensationspolymerisationsreaktion. Für CPH: SA-Synthese wird die Reaktion bei 180 ° C, 0,3 Torr für 1,5 Stunden, aber diese Reaktionsbedingungen wird in den diversen Polymer-Systeme variieren.

2. Kombinatorische Blank und Protein-beladenen Polymer Nanopartikel und Film Library Fabrication - siehe Abbildung 1 für Robotic-Setup

1. Die Spritze in der ersten programmierbaren Spritzenpumpe mit einem Lösungsmittel gefüllt (freilassen library) oder ein Lösungsmittel mit darin dispergierten Protein (Protein-beladenen Bibliothek), während die Spritze in der zweiten SpritzePumpe ist leer. Rohre zur Herstellung Nanopartikel in der benachbarten Probenhalter mit dem Nicht-Lösungsmittel gefüllt (Verhältnis von Lösungsmittel zu Nichtlösungsmittel 1 bis 100). Für Filmherstellung eine leere Multiwellplatte wird anstelle der Rohre in dem benachbarten Probenhalter verwendet.
2. Verwendung des LabVIEW Programms wird das Lösungsmittel in alle Polymer Vials / Vertiefungen der Bibliothek (Konzentration = 20 mg / ml) abgeschieden und inkubiert für 1-5 min. Eine optionale Beschallungsschritt (30 s bei 40 Hz) eingeführt werden, um vollständige Polymerauflösung gewährleisten.
3. Anschließend wird durch Einleiten einer separaten LabVIEW-Programm wird die Probe in die leere Spritze zurückgezogen und hinterlegt in seinem entsprechenden Röhre des Nichtlösungsmittels (Nanopartikel) oder leeren Vertiefung (Filme) in der benachbarten Probenhalter.
4. Dieser Vorgang wird für jede Zusammensetzung des diskreten Polymer-Bibliothek durchgeführt wird.
5. Das Nanopartikel oder Film-Bibliothek wird dann in einer Vakuumkammer für Lösungsmittel und Nicht-Lösungsmittel-Entfernung (das Nanopartikel libra platziertry können auch wieder mittels Vakuumfiltration werden).

3. High-throughput Protein Freisetzungskinetik

1. Zur Untersuchung mit hohem Durchsatz Protein Freisetzungskinetik von einem Polymer Bibliothek, eine 96 tief welled (2 ml / Vertiefung) wird Polypropylen Platte modifiziert, dass die oberen 1/3 von der Bohrlochwand in benachbarten Säulen (Bsp.: A und B, C und D, E und F, G und H) wird entfernt, um die Vertiefungen angrenzen. Die Protein-beladenen Folien müssen hergestellt werden oder die Nanopartikel in diese Platte überführt, um mit hohem Durchsatz Freisetzungskinetik Versuche durchzuführen. Protein-beladenen Nanopartikel oder Filmproben muss nur in einer Vertiefung der angrenzenden Säulen (A, C, E, und G ex) abgegeben werden. Siehe Abbildung 4 für Details.
2. Nach der Übertragung der Nanopartikel an die 96 tief welled Ausrückplatte werden die Partikel absetzen gelassen. PBS-Puffer (0,1 mM, pH 7,4) wird langsam zu jedem Probenbehälter (Spalten A, C, E und G) zugegeben und dann zu jedem benachbarten Schacht (Spalten B, D, F und H), bis die Vertiefungen gefüllt sind, und der Puffer ist frei fließend zwischen benachbarten Vertiefungen. Für Nanopartikel, muss dieser Prozess mit besonderer Vorsicht durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Partikel bleiben an der Unterseite der Probe gut (Spalten A, C, E und G) und nicht in den angrenzenden Release übertragen auch (Spalten B, D, F und H). In einigen Fällen wird Zentrifugieren erforderlich ist, um die Nanopartikel zu lokalisieren Proben am Boden des Probenbehälters (Spalten A, C, E und G).
3. Als nächstes wird die Auslöseplatte mit einem Deckel verschlossen und bei der gewünschten Temperatur (dh 37 ° C) unter Rühren für die Dauer des Experiments.
4. Bei inkrementellen Zeitpunkten (dh 0,04, 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12, 15, 19, 24 und 30 Tage) die Menge des freigesetzten Fluorochrom-konjugiertem Protein wird quantifiziert unter Verwendung eines 9400 Typhoon Flachbett Fluorescent Scanner ( GE Healthcare). Die Freigabeplatte auf dem Scanner platziert ist, abgetastet mit der entsprechenden Laser-Anregung und Emission filters, und die Fluoreszenzintensität des freigesetzten Proteins in der Freigabestellung Vertiefungen (Spalten B, D, F und H) quantifiziert wird (Bild Quant). Es wird vorgeschlagen, dass Protein Standards bekannter Konzentration in der Well-Platte zum Berechnen Proteinmenge und Bilanzierung von Fluorochrom Abschrecken enthalten sein.

4. Repräsentative Ergebnisse

Bei der Herstellung der Polymer-Bibliothek, hat die Charakterisierung wurden mit ¹ H-NMR, GPC und FTIR durchgeführt, um zu überprüfen diese kombinatorische Methode ^1,7,8,11. Molekulargewichte reichen von 10.000-20.000 g / mol, Polydispersität Index reicht von 1,5 bis 3,0, und die chemische Zusammensetzung hat sich gezeigt, um genau zu sein und in Übereinstimmung mit konventionellen Methoden der Polyanhydrid Synthese ^12-15. Ebenso zeigte SEM-Bilder der Nanopartikel Bibliotheken ähnliche Oberflächen-Morphologie, Größe und Größenverteilung als die von herkömmlich hergestellten Nanopartikeln ^2. Protein Freisetzung kinetischcs aus Polyanhydrid Nanopartikel oder Filme erfolgt in einer modifizierten Lochplatte durchgeführt, wie zuvor beschrieben ^ein. Die Ergebnisse zeigten eine ungefähre Freisetzung nullter Ordnung mit oder ohne Burst abhängig Protein Be-und Polymerchemie (Abbildungen 2 und 3) ^1,12,14,16.

Abbildung 1. Kombinatorische Polymerfilm und Nanopartikel Vorrichtung zum Herstellen.

Abbildung 2 Hochdurchsatzforschung Freisetzung von Texas Red Rinderserumalbumin (TRBSA) von einer CPH:. SA Polymernanopartikel Bibliothek. SA-reichen Polymer-Verbindungen freisetzen gekapselt TRBSA am schnellsten, während CPH-reiche Polymer-Chemie die langsamste freizugeben. Fehlerbalken stellen Standardabweichungention und n = 4 ist. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Petersen et. al. ^ein. Copyright 2010 American Chemical Society.

Abbildung 3 Hochdurchsatzforschung Freisetzung von Texas Red Rinderserumalbumin (TRBSA) von einer CPTEG:. CPH Polymerfilm Bibliothek. CPTEG-reichen Polymer-Verbindungen freisetzen gekapselt TRBSA am schnellsten, während CPH-reiche Polymer-Chemie die langsamste freizugeben. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung und n = 3 ist.

Abbildung 4. Das Bild zeigt zwei benachbarte Brunnen "vor" und "nach" Änderung in der 96 tief welled Polypropylen-Platte. Das "nach" Modifikation Bild rechts zeigt auch die Zugabe eines Polymerfilms (unten links Vertiefung) mit einem gekapselten Fluoreszenzmolekülwobei zwischen den beiden Bohrungen in einer Pufferlösung gelöst. Das freigesetzte fluoreszierende Molekül wird dann in die richtige gut detektiert.

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Diskussion

Kenntnis der erforderlichen Synthesebedingungen und den Glasübergangstemperaturen (T _g s) der Polymeren synthetisiert sind für Bibliothek Herstellung. Falls die T _g s unter Raumtemperatur, so kann der Nanopartikel Herstellungsschritt, müssen unter einer kontrollierten Temperatur-Umgebung unterhalb der T _g des Polymers durchgeführt werden. Darüber hinaus sollte mit Vorsicht getroffen werden, um sicherzustellen, dass alle Geräte, die in Kontakt mit hohen Temperaturen und die Lösungs...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Firma	Katalognummer
Motorisierte XYZ Stage: 3x T-LSM050A, 50 mm Stellweg je Achse	Zaber Technologies	T-XYZ-LSM050A-KT04
NE-1000 Einzel-Spritzenpumpe	New Era Pump Systems	NE-1000
Pyrex * Vista * Randlose Reusable Glass Kultur Tubes	Corning	07-250-125
Glasküvetten	Scientific Strategies	G102
LabVIEW	National Instruments	776671-35
SGE Tight Gas-Spritzen, Luer Loc	Sigma Aldrich	509507
U96 DeepWell Platten 1,3 ml & 2,0 ml	Thermo Scientific: Nunc	278743
Nun cap-Matten	Thermo Scientific: Nunc	276000
Typhoon 9400	GE Healthcare	63-0055-79
Whatman Grade 50 Circles 90 mm	Whatman	1450-090