Síntese combinatória de alta capacidade e liberação de proteínas a partir de polímero de Cinema e Bibliotecas Nanopartículas

Resumo

O método descreve a síntese combinatória de película de polianidrido biodegradáveis ​​e bibliotecas de nanopartículas e de detecção de elevado débito de libertação de proteínas a partir destas bibliotecas.

Resumo

Polianidridos são uma classe de biomateriais com excelente biocompatibilidade e capacidade de entrega de drogas. Embora tenham sido estudados extensivamente com convencional de um exemplo de-a-um-tempo técnicas de síntese, uma abordagem mais recente de alto rendimento tem sido desenvolvido permitindo a síntese e teste de grandes bibliotecas de polianidridos ^1. Isto irá facilitar a optimização mais eficiente e processo de concepção desses biomateriais para aplicações de entrega de drogas e vacinas. O método, neste trabalho descreve a síntese combinatória de película de polianidrido biodegradáveis ​​e bibliotecas de nanopartículas e de detecção de elevado débito de libertação de proteínas a partir destas bibliotecas. Neste método roboticamente operado (Figura 1), os actuadores lineares e bombas de seringa são controlados por LabVIEW, que permite que um protocolo de mãos-livres automatizado, eliminando o erro do utilizador. Além disso, este método permite a fabricação rápida de bibliotecas de micro-escala de polímero, vermelhoucing o tamanho do lote, enquanto que resulta na criação de sistemas de multivariante polímero. Esta abordagem combinatória para a síntese do polímero facilita a síntese de até 15 diferentes polímeros em uma quantidade equivalente de tempo que seria necessário para sintetizar um polímero convencional. Além disso, a biblioteca combinatória de polímero pode ser fabricada em geometrias em branco ou proteína-carregado incluindo filmes ou nanopartículas mediante dissolução da biblioteca de polímero em um solvente e precipitação num não-solvente (por nanopartículas), ou por secagem sob vácuo (para filmes). Durante o carregamento de uma proteína conjugados com fluorocromos para as bibliotecas de polímeros, a cinética de libertação de proteína podem ser avaliadas em alto rendimento, utilizando um método de detecção de fluorescência de base (Figuras 2 e 3), conforme descrito anteriormente ^1. Esta plataforma combinatória foi validado com métodos convencionais de ² e a película de polianidrido e bibliotecas de nanopartículas foram caracterizadas com in vitro de toxicidade celular, citocinas, produção superfície marcador de expressão, adesão, proliferação e diferenciação, e na biodistribuição in vivo e mucoadesão ^1-11. O método desenvolvido aqui combinatória permite alto rendimento de síntese de polímeros e fabrico de proteína-carregado de nanopartículas e bibliotecas de película, a qual pode, por sua vez, ser rastreadas in vitro e in vivo para a optimização do desempenho do biomaterial.

Protocolo

1. Combinatória de Polímeros Síntese Library (Variando em Polymer Química) - veja a Figura 1 para a configuração Robotic

1. Dissolver cada monómero na apropriada (concentração = 25 mg / ml) com solvente e carregar cada para uma seringa de 10 cc de gás apertado.
2. Anexar os solventes tubos capilares de bloqueio lure resistentes ao final de cada seringa.
3. Coloque as seringas nas bombas de seringa (New Era bombas de seringa Programáveis) e bloquear a posição.
4. Definir os actuadores lineares (Zaber) para a posição de partida.
5. Usando pinças do suporte do anel, a posição final de ambos os tubos capilares para dentro do frasco de partida / poço de deposição de monómero.
6. Inicie o programa de LabVIEW, que bombeia volumes variáveis ​​de cada monómero em cada poço, dependendo da composição do copolímero pretendido. Isto é conseguido no programa, instruindo o actuador do eixo Z para baixar os tubos capilares para dentro do frasco / recipiente e, em seguida, cada bomba para distribuir o volume desejado. Next, o programa instrui o Z-actuador para retornar à sua posição de repouso e os X e Y actuadores para mover para a posição seguinte do frasco / recipiente. Esta é realizada até que cada poço tem o volume desejado de monómero depositado nele.
7. Na sequência de deposição de monómero, a biblioteca de monómero multi-poços ou multi-frasco é transferido para um forno a vácuo pré-aquecido e incubou-se sob vácuo, durante a duração da reacção de polimerização de condensação. Para CPH: SA síntese a reacção é realizada a 180 ° C, 0,3 torr, durante 1,5 horas, mas estas condições de reacção irá variar entre os diferentes sistemas de polímeros.

2. Combinatória em branco e Proteína-carregado nanopartículas de polímeros e Fabricação Film Library - veja a Figura 1 para a instalação robótica

1. A seringa na bomba de seringa em primeiro lugar programável é preenchido com um solvente (biblioteca em branco) ou com um solvente de proteínas dispersas nele (proteína-loaded biblioteca), enquanto a seringa na segunda seringabomba é deixada em branco. Tubos para o fabrico de nanopartículas no porta-amostras adjacentes são preenchidos com o não-solvente (proporção de solvente para não-solvente é de 1 a 100). Para a fabricação de uma película placa multi-poços vazios é utilizado em vez dos tubos de amostra no suporte adjacente.
2. Utilizando o programa de LabVIEW, o solvente é depositado em todos os frascos de polímero / poços da biblioteca (concentração = 20 mg / ml) e incubou-se durante 1-5 minutos. Um passo opcional sonicação (30 seg a 40 Hz) pode ser introduzido para assegurar a dissolução completa do polímero.
3. Em seguida, ao iniciar um programa LabVIEW separado, a amostra é retirada para a seringa vazia, e depositados na sua correspondente tubo de poço não solvente (nanopartículas) ou vazio (filmes) no porta-amostras adjacentes.
4. Este processo realiza-se, para cada composição da biblioteca de polímero discretas.
5. A nanopartícula ou biblioteca de película é então colocado numa câmara de vácuo para a remoção de solvente e não-solvente (a libra nanopartículary também podem ser recuperados através de filtração por vácuo).

3. Alto rendimento de Lançamento Cinética Proteína

1. Para investigar high-throughput cinéticas de libertação de proteína a partir de uma biblioteca de polímeros, de 96 de profundidade welled (2 ml / poço), a placa de polipropileno é modificado de tal modo que a parte superior de 1/3 a parede do poço, em colunas adjacentes (ex: A e B, C e D, E e F, G e H) é removido para as cavidades adjacentes. Os filmes carregados de proteína devem ser fabricados em ou as nanopartículas transferido para esta placa para realizar estudos de alto rendimento de libertação cinética. As amostras de proteína-carregado de nanopartículas ou película tem de ser colocado apenas em um poço das colunas adjacentes (ex: A, C, E e G). Veja a Figura 4 para detalhes.
2. Após a transferência das nanopartículas de libertação da placa de fundo 96-welled, as partículas são deixadas assentar. Tampão PBS (0,1 mM, pH 7,4) é lentamente adicionada a cada poço de amostra (colunas A, C, E e G) e, em seguida, a cada poço vizinho (colunas B, D, F e H), até que os poços são cheios e o tampão é de fluxo livre entre os poços adjacentes. Para as nanopartículas, este processo necessita de ser efectuado com cuidado extra para assegurar que as partículas permaneçam no fundo do poço de amostra (colunas A, C, E e G) e não transferido para a libertação contígua bem (colunas B, D, F , e H). Em alguns casos, a centrifugação é necessária para localizar as amostras de nanopartículas na parte inferior do poço de amostra (colunas A, C, E e G).
3. Em seguida, a placa de libertação é fechado com uma tampa e colocada à temperatura desejada (isto é, 37 ° C), sob agitação, durante a duração da experiência.
4. Em pontos de tempo incremental (ie 0,04, 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12, 15, 19, 24, e 30 dias) a quantidade de proteína liberada conjugado com fluorocromo é quantificado utilizando um scanner plano Typhoon 9400 Fluorescente ( GE Healthcare). O prato de liberação é colocada sobre a superfície do scanner, digitalizados utilizando o laser de excitação e emissão adequados filters, e a intensidade de fluorescência da proteína libertada nas cavidades de libertação (colunas B, D, F e H) é quantificado (Quant Imagem). Sugere-se que os padrões de concentrações conhecidas de proteína ser incluídos na placa de poço para calcular a quantidade de proteína e de contabilidade para a têmpera fluorocromo.

4. Resultados representativos

Após o fabrico da biblioteca de polímeros, caracterização foi efectuada com ¹ H RMN, GPC, e FTIR para validar este método combinatorial ^1,7,8,11. Gama de pesos moleculares de 10,000-20,000 g / mol, índice varia polidispersão 1,5-3,0, e composição química tem sido mostrado para ser preciso e de acordo com métodos convencionais de síntese de polianidrido ^12-15. Do mesmo modo, as imagens de SEM das bibliotecas de nanopartículas apresentaram morfologia superficial similar, tamanho e distribuição de tamanho como a de nanopartículas convencionalmente fabricadas ^2. Proteína de liberação kinetics a partir de nanopartículas de polianidrido ou películas é levada a cabo numa placa modificada bem como descrito anteriormente ^1. Os resultados revelaram uma libertação de ordem aproximada de zero, com ou sem uma explosão depende da carga de proteína e da química do polímero (Figuras 2 e 3) ^1,12,14,16.

Figura 1. Combinatorial película de polímero e o aparelho de fabricação de nanopartículas.

Figura 2 High-throughput libertação de Texas Red albumina de soro bovino (TRBSA) a partir de um CPH:. SA biblioteca de nanopartículas de polímero. SA químicos ricos polímero encapsulado TRBSA libertar o mais rapidamente, ao passo que produtos químicos CPH-ricos polímero libertar o mais lento. As barras de erro representam desvio padrãoção e n = 4. Reproduzido com a permissão de Petersen et. al. ^1. Copyright 2010 American Chemical Society.

Figura 3 High-throughput libertação de Texas Red albumina de soro bovino (TRBSA) a partir de um CPTEG:. CPH biblioteca película de polímero. Químicas CPTEG ricos polímero encapsulado TRBSA libertar o mais rapidamente, ao passo que produtos químicos CPH-ricos polímero libertar o mais lento. As barras de erro representam o desvio padrão e n = 3.

Figura 4. Imagem mostrando dois poços vizinhos "antes" e modificação "depois" na placa de polipropileno de 96 profundidade de poços. A modificação da imagem "depois" da direita, também descreve a adição de uma película de polímero (parte inferior do lado esquerdo poço) com uma molécula fluorescente encapsuladoser libertado entre os dois poços numa solução tampão. A molécula fluorescente libertado é então detectada no muito bem.

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Discussão

O conhecimento das condições de síntese necessários e as temperaturas de transição vítrea (T _g s) dos polímeros a ser sintetizados são essenciais para o fabrico de biblioteca. Se o T _g s estão abaixo da temperatura ambiente, o passo de fabrico de nanopartículas podem ter de ser realizado num ambiente com temperatura controlada abaixo da _Tg dos polímeros. Além disso, o cuidado deve ser tomado para assegurar que todo o equipamento que entra em contato com altas temperaturas e ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Companhia	Número de catálogo
Estágio motorizado XYZ: 3x T-LSM050A, 50 mm de curso por eixo	Zaber Technologies	T-XYZ-LSM050A-KT04
NE-1000 bomba de seringa única	Sistemas com bombas de Época	NE-1000
Pyrex * Vista * Rimless tubos de cultura de vidro reutilizáveis	Corning	07-250-125
Cubetas de vidro	Estratégias científicos	G102
LabVIEW	National Instruments	776671-35
Seringas SGE gás apertado, Luer Loc	Sigma Aldrich	509507
U96 Deepwell Plates 1,3 ml e 2,0 ml	Thermo Scientific: Nunc	278743
Bem esteiras cap	Thermo Scientific: Nunc	276000
Tufão 9400	GE Healthcare	63-0055-79
Whatman Grade 50 Círculos 90 milímetros	Whatman	1450-090