El uso de la fMRI farmacológico-reto en la investigación preclínica: la aplicación al sistema de 5-HT

Resumen

El objetivo de esta técnica consiste en evaluar la serotonina (5-HT) la función de neurotransmisor en el animal vivo y sin respiración, con imágenes de resonancia magnética farmacológica (phMRI) y un desafío por vía intravenosa con un inhibidor selectivo de la recaptación de serotonina (ISRS), fluoxetina.

Resumen

Farmacológico resonancia magnética (phMRI) es un método nuevo y prometedor para estudiar los efectos de las sustancias sobre las funciones cerebrales que a la larga pueden ser utilizados para desentrañar los mecanismos neurobiológicos subyacentes detrás de la acción de drogas y los trastornos relacionados con los neurotransmisores, como la depresión y el TDAH. Como la mayoría de los métodos de imagen (PET, SPECT, CT), que representa un avance en la investigación de los trastornos del cerebro y la función relacionada de las vías de neurotransmisores en forma no invasiva con respecto a la conectividad neuronal global. Por otra parte, también ofrece la herramienta ideal para la traducción a las investigaciones clínicas. Resonancia magnética, mientras que todavía detrás de las estrategias de imagen molecular en comparación con el PET y SPECT, tiene la gran ventaja de tener una alta resolución espacial y no hay necesidad de que la inyección de un contraste agente o moléculas marcadas por radio, evitando así la exposición repetitiva a las radiaciones ionizantes . Resonancia magnética funcional (fMRI) es ampliamente utilizado en la fijación de la investigación y la clínica, donde es gn general combinado con una tarea psico-motor. phMRI es una adaptación de resonancia magnética funcional que permite la investigación de un sistema neurotransmisor específico, como la serotonina (5-HT), bajo condiciones fisiológicas o patológicas después de la activación a través de la administración de un fármaco estimulante específico.

El objetivo del método descrito aquí es evaluar el cerebro de 5-HT función en los animales libres de respiración. Al desafiar el sistema 5-HT, mientras que al mismo tiempo la adquisición de las imágenes de RM funcionales a través del tiempo, la respuesta del cerebro a este desafío puede ser visualizada. Varios estudios en animales han demostrado ya que la droga-inducida por el aumento en los niveles extracelulares de por ejemplo 5-HT (agentes liberadores, selectivos de la recaptación de los bloqueadores, etc) evocan específicos de la región los cambios en el nivel de oxigenación de la sangre que dependen de señales de resonancia magnética (negrita) (señal debido a un cambio de los niveles de hemoglobina oxigenados / desoxigenada que ocurren durante la activación del cerebro a través de un aumento del suministro de sangre para suministrar el oxígeno y glucose a las neuronas más exigentes) que proporciona un índice de la función del neurotransmisor. También se ha demostrado que estos efectos pueden ser revertidos por los tratamientos que disminuyen la disponibilidad de 5-HT ^16,13,18,7. En ratas adultas, los cambios de señal BOLD siguientes aguda administración ISRS han sido descritos en varias de 5-HT regiones del cerebro relacionadas, es decir, áreas corticales, el hipocampo, el hipotálamo y el tálamo ^9,16,15. La estimulación del sistema 5-HT y su respuesta a este reto se puede por lo tanto utilizarse como una medida de su función en animales y seres humanos ^2,11.

Protocolo

Preparación de los animales in vivo para IRM imágenes

1. La canulación quirúrgica

1. Anestesiar la rata (rata Wistar macho, 200-300 g) con isoflurano (inducción de un 5% y luego se reduce a un 1,5-2% para el mantenimiento de la anestesia durante la preparación de los animales y de exploración) que figura en aire comprimido (21% O _2, BOC Reino Unido) . Asegúrese de que el animal está bien anestesiado y no muestra respuesta a una pizca dedo del pie. La arteria femoral y la vena se canuló para gases en sangre y mediciones de presión sanguínea y la administración del fármaco desafío respectivamente. Durante el procedimiento quirúrgico, la temperatura corporal del animal se controla y mantiene a través de una sonda rectal y una manta térmica (Harvard Apparatus).
2. El animal anestesiado se coloca sobre una almohadilla de calentamiento bajo un microscopio de disección en decúbito dorsal. Afeitar el área de la mitad del muslo y limpiar la piel con alcohol. Haga una incisión de 2 cm de piel a lo largo del pliegue formado por el abdomen y el muslo derecho.La disección roma de los músculos aductores se utiliza para visualizar la arteria femoral vena y el nervio femoral. Separar cuidadosamente los vasos.
3. Suavemente atar una ligadura de seda completamente alrededor del extremo distal del vaso y colocar otro lazo con medio de un nudo quirúrgico con holgura en el sitio proximal. Aplicar la tracción a ambos ligaduras, para ocluir el flujo sanguíneo en la porción media restante del buque expuesta entre las ligaduras. Hacer una pequeña incisión de aproximadamente un tercio de la circunferencia del vaso en esta parte del recipiente para permitir la inserción de una cánula PE-50 (0,54 mm de diámetro interno y 0.96mm para diámetro exterior en el caso de ratas macho adultas, de lo contrario 0,40 mm ID y 0,80 mm ED) en el recipiente.
4. La cánula se debe insertar varios mm (al menos 5) en el recipiente. Una vez en el lumen, lavar una pequeña cantidad de solución salina heparinizada (15 UI / ml) a través del recipiente para evitar cualquier formación de coágulo de sangre. El bucle de seda proximal también se ligó completamente para fijar la cánula. Repita este procedimiento para el segundo recipiente. Pega la piel utilizando un adhesivo tisular Vetbond (3M UK plc, Bracknell, Reino Unido) cuando ambas cánulas están en su lugar. Véase la Figura 1 para la colocación exacta de las cánulas.
5. Colocar el animal en una cama estereotáctica MR compatible (M2M Imaging Corp., EE.UU.) en una posición de decúbito prono. Mantener la cabeza del animal a través de la inserción de las barras de los oídos y un bar de los dientes. En este punto, el animal puede ser colocado en el escáner de resonancia magnética para obtener imágenes. El animal permanece anestesiado y es libre para respirar durante todo el procedimiento de las imágenes.

2. Monitoreo

Durante el procedimiento de imagen completa, varias respuestas fisiológicas deben ser constantemente monitoreados y se mantenga lo más constante posible. Esto es esencial, ya que estas respuestas pueden variar grandemente sobre la ventana mismo tiempo que la señal phMRI y también afecta a la señal de interés. También es importante, dado que el animal se colocó en el MAgnet y por lo tanto fuera de la vista y no susceptibles de control estándar de la profundidad de la anestesia (por ejemplo pizca dedo del pie), para asegurar una adecuada profundidad de la anestesia. Además, teniendo en cuenta que muchos medicamentos alteran los parámetros cardiovasculares como la hipertensión arterial, la medición de estos puntos es fundamental para garantizar la pueden tener en cuenta mundiales de efectos fisiológicos de la acción de la droga en los datos phMRI. Véase también la sección 4 para los valores de referencia y las respuestas esperadas a la infusión de 5 mg / kg de fluoxetina.

1. La temperatura corporal se mantuvo a 37 ± 1,5 ° C por un sistema de calefacción de aire caliente (SA Instruments, Nueva York, EE.UU.). Tenga en cuenta que la RM puede afectar a la medición de temperatura, verifique esto con su propio sistema.
2. Controlar y registrar la velocidad de respiración del animal usando un manguito respiratoria acoplado a un sensor de presión (SA Instruments, Nueva York, EE.UU.).
3. Registrar la presión arterial invasiva utilizando un transductor de presión (TSD104A, Biopac Systems Corp., EE.UU.) y periódicamente retirar unad analizar muestras de gases en sangre arterial (Rapidlab, Siemens de diagnóstico) a través de la arteria femoral canulado en imágenes para vigilar PCO ₂ arterial y la presión parcial de oxígeno (PO _2).
4. El uso de la vena femoral canulada como la línea de infusión principal para el reto farmacológico (fluoxetina (hidrocloruro de fluoxetina de Sigma-Aldrich, Reino Unido) de 5 mg / kg, se disolvió en solución salina).

En vivo de imágenes

Una representación esquemática de la configuración experimental RMf se da en la Figura 2.

3. Los parámetros de imagen

1. Una vez que el animal se encuentre en el interior del escáner y sigue mostrando las respuestas fisiológicas estables, las imágenes se puede iniciar. En nuestros estudios, hemos utilizado un 4,7 T animal pequeño sistema de resonancia magnética (Agilent Technologies) con una cuadratura cilíndrica de transmisión / recepción bobina de RF con un diámetro interior de 72 mm (M2M Imaging Corp., EE.UU.). Hacer una imagen avión de reconocimiento de tres a ap correctamenteOSICIÓN del cerebro en el centro del campo de vista RM y utilizar la corrección de cuña localizada (secuencia fastmap) para mejorar la homogeneidad del campo magnético en el cerebro.
2. Para cada animal, en primer lugar adquirir un volumen de T2 imagen anatómica para el registro y la segmentación. Se utilizó una secuencia de eco de espín turbo con longitud de los trenes de eco = 8; tamaño de la matriz = 256 x 256; FOV = 50 x 50 mm ^2; con la adquisición intercalada de 30 rebanadas coronales contiguas con un espesor de 1 mm, centrada 8 mm caudal al borde posterior del bulbo olfatorio, medias = 4; TR / TE = 5112/60 ms.
3. Asegúrese de que el animal de sus respuestas fisiológicas son constantes antes de iniciar la exploración phMRI. Para la adquisición de series de tiempo, se utilizó el mismo T2 secuencia turbo eco de espín con longitud de los trenes de eco = 16; matriz tamaño = 128 x 128; con la adquisición intercalada de 20 cortes contiguos con un espesor de 1 mm centrada en la misma posición; TR / TE = 4915/60 ms. En total, se adquirieron 32 puntos en el tiempo con uncquisition tiempo de 158 segundos por volumen de series de tiempo y un tiempo de ciclo total de 84 min. El primer volumen se utiliza como un "escaneo ficticio" para hacer frente a los efectos de saturación de T1 y no se utiliza en el análisis de datos. Otras secuencias fMRI como eco de gradiente o eco imagen planar (PAI) secuencias también pueden ser utilizados. Asegúrese de que para evaluar la estabilidad de la señal de la secuencia de elección antes del inicio de su experimento.
4. Adquirir una serie de volúmenes de referencia, antes de administrar el medicamento desafío. Sugerimos al menos 10 minutos de la adquisición de línea de base en condiciones estables. Inicie la infusión a la misma hora para todos los animales. En nuestro protocolo, se inició la administración al comienzo de la novena volumen (después de aproximadamente 21 exploración basal min). Después de la infusión, la adquisición de imágenes continuó durante otros 60 minutos (32 volúmenes en total). Asegúrese de que el período posterior a la infusión es el tiempo suficiente para visualizar los cambios y alcanzar el estado de equilibrio o la recuperación de la señal, dependiendo de su investigación Questiel y su opción de desafío de las drogas.
5. Cuando la adquisición de imágenes se termine, quite el animal desde el escáner. Realizar una medición de la tensión final de gas para garantizar la estabilidad de los parámetros de gases en sangre, y para permitir la evaluación de los efectos del fármaco sobre la fisiología básica.

Proceso de datos

4. Las respuestas fisiológicas

Espera las respuestas fisiológicas al desafío dependen de la droga elegida. A continuación, los valores de referencia generalmente aceptados (de las ratas macho adultas) y las respuestas esperadas a la infusión intravenosa de 5 mg / kg de fluoxetina se dan.

1. La tasa de respiración debe ser estable a 45-75 respiraciones por minuto. El reto farmacológico de la fluoxetina induce un aumento a corto (15-20%) en la tasa de respiración.
2. La presión arterial debe ser constante y entre 100-150 mmHg (Biopac Systems Corp., Goweta, EE.UU.). El desafío fluoxetina induce una caída corta pero empinada de aproximadamente 20% de la presión arterial.Esto debería recuperarse en 5-10 minutos. Esto se muestra en la Figura 3.
3. Los valores de gases en sangre debe ser estable (medir por lo menos dos veces) y dentro de los rangos siguientes antes de comenzar la exploración phMRI: pCO _2, 35-45 mmHg; PO _2, 80-130 mmHg, pH, 7,35 a 7,45. Compruebe siempre estos valores de nuevo después de la exploración para ver si el animal se mantuvo estable y para permitir la evaluación de los efectos del fármaco sobre la fisiología básica. Altas pCO ₂ valores inducir vasodilatación y por lo tanto se evitará ver los cambios de señal BOLD.
4. Asegúrese de que el animal se encuentra en un nivel continuo y constante de la anestesia (2 ± 0,25%; los niveles más altos puede causar la depresión de la reactividad vascular cerebral y menor la anestesia insuficiente y por lo tanto el movimiento), antes de iniciar la exploración phMRI y lo más importante, evitar que los ajustes en la régimen de la anestesia (por ejemplo,% de isoflurano y / o el flujo de gas) durante la adquisición de la imagen funcional, ya que esto también podría afectar a la señal BOLD.

5. Preprocesamiento de datos de resonancia magnética

A continuación se describen varios pasos en el pre-procesamiento de los datos de RM con el fin de optimalize los datos para el análisis estadístico. Mencionamos las herramientas que se utilizan en nuestro laboratorio, sin embargo muchas herramientas diferentes están disponibles.

5.1 Preparación de datos

1. Coloque las imágenes en bruto en el formato de archivo correcto para el software de análisis de resonancia magnética que usted prefiere usar (o NIfTI1.1 Analyze7.5 formato para los programas de FSL). Varios programas gratuitos convertidor de archivos están disponibles en línea. Dependiendo del escáner utilizado, puede ser necesario construir primero un 3D (exploración anatómica) o 4D (phMRI exploración) de la imagen de todos los cortes 2D separadas. Esto puede hacerse utilizando un programa de procesamiento de imagen, tales como ImageJ ^1.
2. Con el fin de asegurar la compatibilidad con los algoritmos de análisis diseñadas para su uso con los datos en humanos (por ejemplo, los programas de FSL), el tamaño de voxel tiene que ser multiplicado por un factor 10 (esto también se puede hacer utilizando, por ejemplo ImageJ). En nuestro estudio, esto se tradujo en un tamaño de voxel de 3,91 x 3,91 x 10 mm ^3.
3. Inspeccione visualmente las imágenes de las irregularidades en la orientación, artefactos, y el movimiento. Tenga cuidado de no utilizar las exploraciones con objetos claros o movimiento excesivo en sus análisis, ya que le distorsionar los resultados.
4. La orientación de todos los análisis deben ser similares entre las imágenes anatómicas y funcionales y en concordancia con el cerebro de referencia utilizado. En nuestro estudio, hemos utilizado el modelo de cerebro de rata estereotáctica descrito por Schwarz ^14. La FSL comando fslswapdim se puede utilizar para reorientar.

5.2 Propuesta de corrección de

1. Para corregir los artefactos de movimiento de la serie 4D en tiempo, se utilizó la herramienta de corrección de movimiento McFlirt (corrección de movimiento lineal utilizando FMRIB la herramienta de registro de imagen, que forma parte de la biblioteca de software de FMRIB, www.fmrib.ox.ac.uk / FSL ). MCFLIRT es una intra-modal de movimiento de corrección de herramienta de des-igned para su uso en la serie de tiempo de resonancia magnética funcional y basada en la optimización y las técnicas de registro utilizadas en FLIRT, una herramienta totalmente automatizada para lineal (afín) intermodal de registro de imágenes del cerebro. Siempre revise más tarde si el resultado es satisfactorio.

5.3 Segmentación del cerebro

1. Eliminar todo el tejido no-cerebro de una imagen de toda la cabeza tanto para la serie de tiempo 4D como la imagen anatómica 3D. Para ello se utilizó la herramienta de FSL BET (Brain Extraction Tool v 2.1, que forma parte de la biblioteca de software de FMRIB, www.fmrib.ox.ac.uk / FSL ). Los ajustes por defecto se han desarrollado para su uso con cerebros humanos y, por tanto no es ideal para el cerebro de rata. Se utilizaron los siguientes parámetros: umbral de la intensidad fraccional, f = 1,0; gradiente vertical en el umbral de la intensidad fraccional, g = 0,1; radio y la cabeza (en mm), r = 175 para la mayoría de los animales. Si es necesario, puede optimizar los valores de cada sujeto.

6. Datos Analysis

Objetivo del análisis estadístico de los datos de RM es determinar los voxels que exhiben variación adicional atribuible al desafío de las drogas de una manera estadísticamente robusto. Diversos enfoques metodológicos disponibles para este, así como paquetes de software numerables. La elección que haga depende de la disponibilidad del software y el conocimiento / experiencia en su laboratorio y su pregunta de investigación específica. A continuación te damos un método sugerido que se utiliza en nuestro laboratorio.

6.1

1. Antes de analizar los datos de resonancia magnética, determina un modelo lineal general (GLM) para que los datos se instalarán. Esto puede ser un simple cuadrado de encendido-apagado modelo (apagado para el pre-droga y el post-infusión de la droga) o un modelo específico basado en los datos. Hemos utilizado el programa Estimular ²¹ para determinar un modelo GLM basado en datos.
2. Realizar una muestra de dos t-test (por ejemplo, en Estimular) en todos los volúmenes de referencia frente a todos los volúmenes después del desafío. Si lo desea, deje out el primer volumen (s) y el volumen durante el cual se le da el desafío, ya los que no puede representar el estado estacionario de imágenes. Posteriormente, discrimina todos los voxels con más de un cambio de cierta% respecto al valor basal. Hemos utilizado todos los voxels con el cambio más del 1%.
3. A continuación, la media del tiempo de evolución en todos estos voxels, que ya le da una impresión de la forma del modelo. De esta manera se puede determinar si el desafío 1) tiene un efecto inmediato o retardado, 2) si y cuando el efecto alcanza una meseta y / o pico y, 3) si o cuando el efecto disminuye de nuevo durante el curso temporal del escanear. Los ejemplos se muestra en la Figura 4A y 4B.

6.2

El siguiente paso es entonces para probar estadísticamente el momento en bruto 4D imagen serie de cada animal contra el modelo GLM anterior establecido. Para ello, se utilizó el programa de FSL FEAT (FMRI herramienta de análisis de expertos, v5.98) ^17,24. Sin embargo, otras herramientas de análisis de resonancia magnética funcional son disponible también. Dentro de la herramienta de análisis, un análisis de primer nivel tiene que ser configurado. Esto requiere los siguientes pasos:

1. Asegúrese de utilizar la misma configuración para cada animal. Usted puede optar por eliminar los primeros (dos) volúmenes antes de su análisis, ya que el estado de equilibrio de imagen no puede ser alcanzado sin embargo, en ese punto. Establecer el TR, este es el tiempo (en segundos) entre el comienzo de cada volumen sucesivo. Puesto que usted está buscando en los efectos que podría durar el tiempo de ciclo completo, no hay necesidad de establecer un filtro de paso alto o bajo.
2. Espacialmente suavizar los datos con el fin de reducir el ruido y mejorar la relación señal a ruido (SNR). Elegimos un kernel FWHM de 8 mm.
3. Ahora ejecuta el modelo GLM deseado en sus datos. Esta es su principal variable explicativa (EV), es decir, la forma de onda que se está probando sus datos en contra. El GLM que se determinó en base a nuestros propios datos puede verse en la Figura 4C. También existe la posibilidad de añadir adicional confundir EV tales como los parámetros de movimiento,ruido de baja frecuencia (deriva del escáner) o incluso de los parámetros fisiológicos como la presión arterial para eliminar fisiológicas generales de drogas de efectos.
   Dentro de FEAT: Uso CINE prewhitening. Añadir derivada temporal. En la pestaña de contrastes y las pruebas F, establecer un contraste. Para convertir un EV sola en una imagen estadística de Z, establezca su valor en contraste con el 1. Esto le da todos los voxels en el que puede ser su evolución en el tiempo de manera significativa se explica por el GLM. Establecer el valor a -1 dará la activación negativa.
   
4. Después de realizar la prueba estadística inicial, la imagen estadístico resultante debe ser umbralizadas para mostrar que los voxels o grupos de voxels se activan en un nivel de significación particular. Corrección de comparaciones múltiples se realizaron debido a la gran cantidad de voxels del cerebro a prueba. La hazaña del programa FSL utiliza un sistema automatizado de cluster basado en la corrección de comparaciones múltiples basado en el GRF (campo de Gauss al azar) la teoría ^25.
5. Por último, los datos deben ser espacialmente normalizaron a una imagen de referencia, con el fin de realizar las estadísticas de grupo. Primero registrar los datos funcionales a los animales de la imagen cerebral se extrajo anatómica y luego a la imagen de referencia. Se utilizó la plantilla de cerebro de rata estereotáxica descrito por Schwarz ¹⁴ como un cerebro de referencia.
6. Después de esto, los análisis de primer nivel de todos los animales se pueden combinar en un nivel superior (grupo) análisis estadísticos. Esto depende en gran medida el diseño de su propio estudio y preguntas de investigación.

6.3

Después de esto, los análisis de primer nivel de todos los animales se pueden combinar en un nivel superior (grupo) análisis estadísticos. Esto depende en gran medida el diseño de su propio estudio y preguntas de investigación.

6.4

Respuestas fisiológicas de drogas pueden ser acopladas o correlacionada con la señal de RM, si se desea. Véase también la sección 6.2.3 sobre la adición de confundir la EV.

7. Los resultados representativos

ove_content "> Cuando la droga estimulante (5 mg / kg iv fluoxetina) entra en el sistema vascular, una respuesta fisiológica clara debe ser visible en la tasa de respiración (arriba) y la presión arterial (abajo). Estas respuestas normalizar en una media de 5-10 minutos . En la Figura 3 esta caída en la presión arterial es claramente visible.

El curso de la señal promedio de tiempo debe mostrar una línea de base relativamente estable, y un claro efecto de la recusación. Preferiblemente, no debe haber ninguna deriva desafío-independiente de la señal. Un ejemplo representativo de un curso de señal promedio de tiempo se puede ver en la Figura 5A. Los artefactos, como la depresión respiratoria / falla o los cambios en la anestesia son a menudo claramente visible en la señal. La depresión respiratoria afectará negativamente a la señal en todo el cerebro. Esto puede verse en la Figura 5B.

Después de análisis de primer nivel, el patrón de activación se espera que sea principalmente positiva y localizaciónTed en regiones específicas solamente (es decir, las áreas corticales, el hipocampo, el hipotálamo y el tálamo, ver Figura 6). Si el cerebro se desactiva, esto es a menudo una indicación de la anestesia demasiado profunda y / o falta de oxígeno durante la exploración. Un ejemplo de esto puede verse en la Figura 6B.

Figura 1. Localización de colocación de las cánulas en la arteria y la vena femoral.

Figura 2 Representación esquemática de la configuración de RMN;. Todo el equipo tiene que ser no ferromagnético y está conectado a un sistema de módulo que permite la adquisición de imágenes cerrada evitando interferencias de movimiento debido a la respiración y / o latidos del corazón. La temperatura corporal también está regulada a través de un módulo de calentamiento para supervisar y controlar la temperatura de los animales durante la exploración. Haga clic aquí para ampliar la imagen .

Figura 3. Ejemplo representativo de los datos de presión arterial. Hay una caída clara en la presión arterial visibles directamente después del inicio de la infusión (barra roja). Los valores normales se alcanzan de nuevo dentro de 10 minutos. después de la administración desafío.

Figura 4. Un patrón) esperado de activación mediante el programa de análisis de resonancia magnética Estimular (rojo es la activación positiva, el azul es la activación negativa). B) Por supuesto el tiempo promedio de todos los voxels activados (cambio ≥ 1% del valor basal) en todos los animales. C) Ejemplo del modelo GLM resulta en FSL / FEAT. Click aquí para ver más grande figura.

Figura 5.

1. Ejemplo de activación positiva. El curso temporal en los voxels activados (rojo) está siguiendo aproximadamente la forma del modelo GLM. La infusión de la droga comenzó alrededor de momento el punto 8.
2. Ejemplo de activación negativa en todo el cerebro después de la anestesia demasiado profundo. El curso temporal de los voxels activados negativa (azul) muestran una disminución general de la señal y ningún efecto de la impugnación es visible.

Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 6.

1. Se espera patrón de activación después de un análisis de primer nivel. La activación de los conglomerados de voxels (rojo ayEllow), sólo en áreas específicas del cerebro.
2. Ejemplo de patrón de "malo" de activación. La activación del cerebro entero negativo (azul) en el mismo animal que en la figura 5B.

Discusión

5-HT phMRI es una herramienta prometedora para evaluar la función del neurotransmisor en animales in vivo. Se visualiza la respuesta cerebral a un reto de 5-HT, con la RM funcional. RM tiene la gran ventaja de tener una alta resolución espacial y no necesita la inyección de contraste, agente o moléculas marcadas por radio, evitando así la exposición repetitiva a las radiaciones ionizantes. Esta técnica es aplicable en los sujetos humanos y animales y por lo tanto muy adecuado para la investigación traslacional de los sistemas neurotransmisores y trastornos psiquiátricos. Su aplicación es por supuesto no se limita a la vía de la 5-HT y ya ha sido ampliamente utilizado para evaluar los efectos de los fármacos dopaminérgicos en ambos ^5,15 animales y seres humanos ^22.

Sin embargo, phMRI en pequeños animales sigue siendo un reto, como ya se ha señalado en los artículos de revisión por parte de Martín y ^{11 de} Sibson y Steward ^20. Uno de estos retos es el mantenimiento of parámetros estables fisiológicos durante la adquisición de la imagen. La mayoría de los anestésicos pueden alterar la función cardiovascular y teniendo en cuenta que phMRI es críticamente dependiente de los parámetros cardiovasculares / hemodinámico es esencial para asegurar que los cambios hemodinámicos son imputables exclusivamente al desafío fármaco determinado. Por consiguiente, es de vital importancia que pCO ₂ niveles se mantienen constantes durante la adquisición de línea de base. La ventilación mecánica puede ayudar a asegurar la estabilidad fisiológica, y se utiliza a menudo en este tipo de experimentos. Nosotros, sin embargo optó por utilizar de libre respiración de los animales para dejar abierta la posibilidad de realizar estudios longitudinales en el futuro. En su lugar, ampliamente monitoreado (y alterado) la tasa de respiración y los valores de gases en sangre para asegurar la estabilidad fisiológica dentro de los intervalos normales antes de iniciar la exploración funcional y de esta manera para preservar la reactividad vascular estable y, por tanto T2 * / señal en T2. La literatura sobre los efectos de los anestésicos generales sobre la hemodinámica cerebral y metabolism es abundante ²⁰ y más allá del alcance de este manuscrito. Se optó por utilizar anestesia con gas, con el ± 2% de isoflurano en este protocolo específico, ya que con anestésicos inhalatorios, la profundidad de la anestesia puede ser rápida y fácil de controlar. Esto es importante en nuestra configuración para garantizar normales rango estable pCO ₂ niveles antes del comienzo de la adquisición de la imagen. El isoflurano es el más comúnmente utilizado hoy anestésico por inhalación y permite una rápida inducción y recuperación, lo cual es importante para estudios longitudinales. También produce una mínima depresión cardiovascular y respiratoria y provoca una buena relajación de los músculos esqueléticos.

En segundo lugar, la administración intravenosa del fármaco estimulante es más complicado en animales pequeños que en los seres humanos. La cirugía que se necesita para la canalización de la arteria y la vena femoral requiere personal bien capacitado y con experiencia. Debido a estos procedimientos invasivos es en este momento utiliza principalmente en los procedimientos de terminales. Sin embargo, la monitorización no invasiva de la homeostasis de sangre y la inyección de vena de la cola podría ser utilizado para estudios longitudinales ^23.

Además, hay algunas limitaciones más generales a la técnica, que no son específicos para los animales phMRI. Además, como se ha señalado por Martin y Sibson ^11, un potencial de confundir todos los estudios fMRI es que se supone que los cambios en la actividad cerebral evocadas por el desafío reflejar cambios en la actividad neuronal en lugar de periféricos efectos sistémicos. Especialmente en las estructuras cerebrales más profundas, una comprensión relativamente pobre de acoplamiento neurovascular (relación entre los cambios de actividad neuronal y los cambios hemodinámicos) se mantiene. Estudios del tipo realizado por Logothetis ¹⁰ para determinar acoplamiento neurovascular en la corteza todavía no se han realizado en otras partes del cerebro. Por lo tanto, se desconoce lo que un aumento en la señal BOLD con estructuras importantes como el estriado o la amígdala es telling nosotros acerca de la actividad neuronal. Lo mejor que podría decir en este momento es que la región del cerebro reacciona ante el desafío dado y que, dependiendo del tratamiento y / o las condiciones, podemos observar los cambios significativos de la reactividad del cerebro. Este gran medida puede ser verificada por mirando a la vez los datos de resonancia magnética y las respuestas fisiológicas. El patrón general de la activación cerebral debe ser región específica y restringida a las áreas con, en este caso, una inervación de alta de 5-HT, y no tanto una respuesta vascular en general. Además, un perfil diferente temporal entre los cambios vasculares y hemodinámicas que se espera. Considerando que los cambios de presión arterial volver a sus valores basales dentro de varios minutos, el efecto del fármaco sobre la activación BOLD es en el caso de fluoxetina visible hasta el final de la adquisición de imágenes y corresponden a las propiedades farmacocinéticas conocen de este fármaco. Finalmente, las respuestas fisiológicas de todos los animales deben ser similares a fin de hacer comparaciones entre sujetos. NonetheleSS, se sabe que una regulación neurogénica del flujo sanguíneo local por 5-HT existen ^4. Por lo tanto, no puede excluirse que los cambios locales de señal BOLD puede atribuir a los cambios vasculares debido a la liberación de 5-HT en la proximidad de los vasos. Aunque estos efectos no están asociados a la activación neuronal local y por lo tanto se puede considerar como resultados positivos falsos, es también un índice de la función general específica del sistema de 5-HT (véase también ^3).

Los pasos críticos de esta técnica son por lo tanto, para controlar las respuestas fisiológicas y extensamente para asegurarse de que las condiciones fisiológicas del animal son estables antes y durante la adquisición de la imagen. También las condiciones del escáner debe ser tan estable como sea posible y exactamente el mismo para cada animal. Estabilidad de la señal de la secuencia deben ser verificadas y confirmadas antes del inicio de su experimento. Además, asegúrese de tener siempre gran potencia estadística suficiente, incluso con grou sujeto pequeñops. Para una buena revisión de las consideraciones experimentales de animales phMRI en general, vea Steward ²⁰ y para ver un ejemplo adicional de un protocolo experimental para la resonancia magnética funcional farmacológica en ratas y ratones, ver a Ferrari ^5.

Las posibles modificaciones de la técnica que se describen aquí son numerosos. Uno podría:

1. usando un medicamento diferente para el 5-HT reto, como otro ISRS o receptor 5-HT (hormiga) agonistas ^16,13,18,7 o incluso a un doble desafío con el fin de revelar los mecanismos subyacentes de la acción del fármaco ^6,19;
2. utilizar una configuración diferente experimental, tales como un régimen diferente de anestesia, ventilación mecánica, la piscina de sangre en lugar de agentes de contraste BOLD ^15, los estudios longitudinales (animal necesita para mantenerse vivo, por lo que la sangre no invasiva de la presión / de sangre de medición de gas y / o ventilación mecánica es posible), o incluso combinaciones con otros (invasivo) los métodos, como la grabación de la actividad neuronal con la RM compatible con elementosctrodes ¹⁰ o PET / SPECT ^4;
3. utilizar diferentes métodos de análisis de datos de resonancia magnética como método de la "p-bloque" de McKie ¹² o el análisis de la conectividad funcional ^15.

¿Qué decisiones que tomas en el montaje experimental es altamente dependiente de las posibilidades y / o la experiencia dentro de su laboratorio y el tipo de pregunta de investigación que le gustaría contestar.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo / equipo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
El isoflurano	ABBOTT Abbott Laboratories Ltd., Maidenhead, Reino Unido	No B506	Mezcla con el aire médica
Médico de aire	BOC Salud
Almohadilla eléctrica	Harvard aparatos	507223F Sistema completo Manta homeotérmicos con sonda flexible, medio, 230 VAC, 50 Hz
L de la Seda igature	http://www.harvardapparatus.com/	2-0 de seda negro trenzado no absorbible Cat Num 51-7631
PE-50 Cánula	http://www.scientificlabs.co.uk/~~V	Portex tubería PE 0.58x0.96mm	0.58 ID 0.96 mm OD
Heparina sódica	Leo Laboratories Ltd, Bucks., Reino Unido	1000IU/ml Heparina sódica	15 U / ml
Adhesivo tisular Vetbond	3M	ttp :/ / solutions.3m.co.uk/wps/portal/3M/en_GB/HealthCare/Home/ProdInfo/VetProducts o "target =" _blank "> M adhesivo tisular Vetbond
Sistema de seguimiento	Instrumentos SA	http://www.i4sa.com Modelo de sistema de monitoreo 1025L	Los monitores de respiración y la temperatura
Transductor de presión	Biopac Systems Corp	TRANSDUCTOR DE PRESION ARTERIAL - TSD104A SISTEMA DE ADQUISICIÓN DE DATOS MP150 - WIN - MP150WSW	Monitores de presión arterial
Analizador de gases de la sangre Rapidlab	Siemens Medical Solutions Diagnostics	Rapidlab 248/348 Sistemas
Escáner de animales 4.7T	Agilent Technologies (anteriormente Magnex) Frecuencia de 199.845 MHz 4.7T
MR cama estereotáctica compatibles	M2M Imaging Corp	Cama de la rata: el elemento PA multi AHS 50-72-1003/100
Bobina	M2M Imaging Corp	Volumen TH / Rx RQD1 72/112 200
Clorhidrato de Fluoxetina	Sigma-Aldrich	F-132	5mg/kg en solución salina